Summary
Bir ELISA kolayca Luminex xMAP assay dönüştürülebilir ve, çoğullama, çeşitli antikorların avantajları ile tahlil maliyet düşürürken, artan duyarlılık ve dinamik aralığı ile sonuçlanan, optimum bir antikor çifti tanımlamak için eşzamanlı taranabilir.
Abstract
Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) uzun yaşam bilim araştırma ve klinik teşhis hem de biyolojik örnekler ilgi analitlerin tespiti için temel araç olmuştur. Bununla birlikte, ELISA sınırlamaları vardır. Bu, tipik olarak bir 96-kuyucuklu mikroplaka gerçekleştirilir ve kuyuları, ilgilenilen bir antijen yakalamak için örnek nispeten büyük bir miktarda gerektiren, yakalama antikoru ile kaplanır. Kuyularının geniş yüzey alanına ve antikor çekimi hidrofobik bağlayıcı da spesifik olmayan bağlama ve yüksek arka yol açabilir. Ayrıca, çoğu ELISA'lar makul bir hassasiyeti elde etmek için sinyallerin enzim-aracılı amplifikasyon dayanır. Böyle amplifikasyon her zaman doğrusal değildir ve can böylece çarpık sonuçlar.
Geçen 15 yıl içinde, yeni bir teknoloji benzer bir wo ile, bu ELISA faydalar sunar, aynı zamanda daha yüksek verim, yüksek esneklik, azaltılmış örnek hacmi ve düşük maliyet sağlayan ortaya çıkmıştırrkflow 1, 2. Luminex xMAP Teknoloji monoplex protein ve nükleik asit uygulamalarının 3-5 hem uygulanabilir multipleks testler ile birlikte etkin bir mikroküre (boncuk) dizi platformudur. Boncuklar ELISA ile karşılaştırıldığında, daha az ve daha küçük antikor çekimi Örnek miktarlara, kovalent olarak daha küçük bir yüzey alanı üzerine sabitlenmiş yakalama antikoru sahiptir, ve spesifik olmayan bağlanma önemli ölçüde azalır. Gibi beyin omurilik sıvısı, eklem sıvısı, vb 6 gibi sınırlayıcı örnekleri ile çalışırken daha küçük örnek hacmi önemlidir. Tahlil multiplekslemesi daha tek bir örnekten çok sayıda sonuç sağlayarak, örnek hacmi gereksinimlerini azaltır.
Luminex tarafından son gelişmeler şunlardır: Yeni MAGPIX sistemi, bir küçük, daha ucuz, kolay kullanımlı analizörü; Düşük Konsantrasyon Manyetik MagPlex Mikroküreler pahalı filtre plakaları olan ihtiyacı ortadan kaldırmak ve daha iyi analiz gelişimi için uygun bir çalışma konsantrasyonu gelir vedüşük hacimli uygulamalar ve xMAP Antikor Kaplin (AbC) Kit, bir protokol, reaktifler ve ilgi yakalama antikor boncuk bağlanması için gerekli sarf malzemeleri içerir. (Kit içeriğini ayrıntılı bir listesi için malzemeler bölümüne bakınız.)
Bu deneyde, biz xMAP platformuna TNF-alfa sitokin için bir ön optimize ELISA testi dönüştürmek ve iki yöntem 7-11 performansını karşılaştırmak. TNF-alfa otoimmün hastalığı olan hastalarda inflamatuar yanıtların ölçümünde kullanılan bir biyolojik belirteç olduğunu.
Biz dört farklı mikroküre setleri veya bölgelere dört aday yakalama antikorlar kaplin ile başlar. Birlikte karıştırıldığında, bu dört takım iyi antikor çifti, tasarruf reaktifler, örnek ve zamanı belirlemek için dört ayrı algılama antikorlar ile dört adayların aynı anda test için izin verir. İki xMAP testlerin ardından iki en iyi antikor çiftleri ile inşa ve performans edilirsinyal gücü, dinamik aralık ve duyarlılık konusunda özgün ELISA testi kıyasla.
Protocol
I. Reaktif Hazırlama
- Antikor Seçimi ve Hazırlanması
- Deneyinde kullanılacak olan antikorlar tanımlar.
- Dört yakalama antikorlar: monoklonal veya poliklonal ya insan TNF-alfa, özel, tüm aynı ana türler.
- Dört algılama antikorlar: insan biyotinile ya değiştirilmemiş TNF-alfa,,, ya PE-konjuge için özel.
- Bir teyidi antikoru: PE-konjuge ve antikor çekimi ana türler için spesifik.
- Üretici tarafından önerilen çalışma yoğunluklarına çözün tüm antikorlar.
- Düşük Konsantrasyon MagPlex mikroküre (boncuk) setleri veya bölgelerde dört şişe seçin, örneğin, Luminex parça numaraları MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID ve MC10015-ID.
- Deneyinde kullanılacak olan antikorlar tanımlar.
- XMAP Antikor (AbC) Kaplin kiti kullanılarak, MagPlex Mikroküreler karşı antikorlar Kaplin
Rekomple kaplin prosedürü için AbC Seti Kullanım Kılavuzu (Part # 89-00002-00-319) için fer. (Not: Mümkün Fotosensitif mikroküreler ışıktan korunmalıdır.)- Eşleme tepkimesi için seçilen boncuk bölgesi numaraları ile oda sıcaklığında ve etiket dört reaksiyon tüplerine AbC kiti içinde reaktiflerin getirir. Dört etiketli reaksiyon tüpleri içine MagPlex boncukların dört şişe (1 mL, her veya 2.5 x 10 6 boncuklar) içeriğini transfer edin.
- Olarak AbC kiti kılavuzda açıklanan Aktivasyon Tampon, 500 uL iki kez boncuk seti her yıkayın.
- AbC kiti kılavuzunda prosedüre göre, aktivasyon tamponu, sülfo-NHS 10 uL, ve EDC reaktifin 10 ul 480 ul her bir boncuk grubu etkin ve 20 dakika süreyle inkübe edilir. (Not:. EDC reaktifi bu adımı hemen önce Aktivasyon Buffer 250 uL olarak yeniden olmalıdır)
- Thr toplam şimdi "aktif" mikrosferler ile önceki yıkama adımıAktivasyon Tampon 500 uL ee kez olarak AbC kiti kılavuzda açıklanan.
- Dört ayrı çözümler, Aktivasyon tampon yakalama antikor her biri 7.5 mg (yani, 3 g / milyon mikroküreler) hazırlayın.
- Hemen girdap, kendi reaksiyon tüpleri için her bir tüpü bu dört yakalama antikor çözümleri ekleyin ve bir rotator iki saat inkübe edin.
- Şimdi AbC kiti ile birlikte Yıkama Tamponu 500 uL üç kez toplam "birleştirilmiş" mikrosferler ile önceki yıkama adımı yineleyin.
- En son yıkama adımdan sonra, mililitrede 5 milyon antikor-coupled boncuk son bir stok konsantrasyonu sağlamak için her reaksiyon tüpüne 500 uL Yıkama Tamponu ekleyin. Vortex ve mikroküreler dağıtmak için reaksiyon tüpleri ses dalgalarına maruz.
NOT: Kısmen DI su ile dolu bir ultrasonik temizleyiciye kapalı mikroküre flakon daldırarak tüm yıkama adımları için etkili sonikasyon sağlar. (E için malzemeler tabloya bakınquipment ayrıntıları.) - 2-8 birleştiğinde boncuklar ° C'nin ve ihtiyaç kadar ışıktan korunmalıdır.
- Coupled Mikroküreler sayımı
- Hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak birleştirme tepkimesinden sonra kurtarıldı mikroküre sayısını. Bunu yapmak için uygun talimatlar için sayım cihazı kullanım kılavuzuna başvurun. Eşleme tepkimesi ile geri kazanım 90 üzerinde% tipik olarak.
- Kaplin Onay
- Bağlama reaksiyonu, onaylamak tayin tamponu içinde 100 boncuklar / ul son konsantrasyon (% 1 BSA ile PBS) ile birlikte, her grubu için akuple boncuk stoklarının test solüsyonları hazırlayarak başarılı olmuştur. Deney tamponu içerisinde 4 ug / mL 'de phycoerythrin-(PE-) etiketli anti-IgG türler teyidi antikoru ile dilüe.
- 16 kuyu olmak üzere toplam bir yuvarlak tabanlı, 96-plaka dört kuyu, içine her test çözüm kısım 50 uL. Daha sonra 50 μ ekleyinArka plan ve sekiz kalan kuyulara seyreltilmiş onay antikor 50 uL ölçmek için kuyu sekiz içine Assay Tampon L,.
- Bir çok kanallı pipet ile birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve yavaşça reaksiyonlar karıştırın. Kapak plakası, bir plaka karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Çözeltinin içinde boncuklar çizmek için 1-2 dakika için manyetik bir levha üzerine ayırıcı plaka yerleştirin. Sonra, bir atık, ayırıcı iken, zorla ters plaka ile sıvı çıkarın.
- Deney tamponu 100 ul ekleyerek ve manyetik plakası ayırıcı kullanılarak benzer bir şekilde plakadan süpernatan kaldırarak iki kez de, her yıkanır.
- Hafifçe çok kanallı pipet ile beş kez aşağı yukarı pipetleme tarafından Assay Tampon 100 uL içinde boncuklar yeniden süspanse edin.
- Böyle MAGPIX Enstrüman olarak Luminex xMAP enstrüman, analiz edin. Bu reaksiyon flüoresan sinyalinin yoğunluğu directl olduğuy, boncukların yüzeyinde protein miktarı ile orantılı boncuklar akuple protein miktarının nispi bir hızla değerlendirmesi vermektedir.
- Algılama için Değiştirilmemiş Antikorlar için Biotin Kaplin
- Değiştirilmemiş algılama antikorlar kullanıyorsanız, Thermo Fisher EZ-Link sülfo-NHS-LC-Biotin Reaktif (Cat.No. PI-21335) ve prospektüste tanımlanan prosedüre bu antikorlar biotinylate. Onlar xMAP analizörü ile tespit edilebilir, böylece bir kez biyotinile, algılama antikorlar daha sonra tayininde streptavidin fikoeritrin (SA-PE) (Adım III.6.) Ile etiketli olabilir.
II. Test Kurulum
- XMAP Assay sahip en etkili olduğunu belirlemek için% 1 BSA (tayin tamponu. Malzeme tablosu) ile PBS 0.96 mL, her biri 10 uL ilave edilerek tüm dört boncuk seti bir başlangıç karışımı hazırlandı.
- Dil ile tespit antikor çözümler hazırlayın1 ug / mL, tayin tamponu içinde, her uting.
- Test Tampon pg / mL 2000 R & D Systems, TNF-α protein standart hazırlayın.
- 8 ug / mL, tayin tamponu içinde üzere Streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (@ 1 mg / mL sağlanan) ile seyreltilir.
III. Antikor Tarama
- Tarama deneyi için bir Costar yuvarlak tabanlı 96-kuyulu plakanın 16 kuyu her birine antikoru-kupleli mikrosfer karışımı 50 uL ekleyin.
- Arka plan ölçmek için, 16 kuyu 8 ila deney tamponu 50 uL ekleyin.
- Yanıtı ölçmek için, diğer 8 kuyu için R & D Systems TNF-α standart (@ 2,000 pg / mL) 50 uL ekleyin.
- Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan oda sıcaklığında, bir saat boyunca inkübe edilir.
- Bir test plakası üzerine sha çalkalanırken, dört kuyucuk (iki arka plan ve iki tepkisi) için dört algılama antikorların her biri 50 uL ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübeker.
- Bütün kuyucuklara SA-PE reaktifin 50 uL ekleyin ve bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- Bir dakika boyunca manyetik bir levha üzerine ayırıcı plaka yerleştirmek ve sonra zorla ters plakası tarafından sıvıyı.
- 16 kuyu her birine 100 uL deney tamponu ekleme, bir dakika süreyle plaka manyetik ayırıcı plaka üzerine yerleştirmek ve daha sonra da ayırıcı üzerinde güçlü bir şekilde ters plakası tarafından sıvıyı.
- 16 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin ve Luminex MAGPIX alet ile plaka okuma; düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakarak.
- İstediğiniz sinyal gücünü karşılayan bir antikor çifti seçin.
IV. xMAP Fonksiyonel analizde
- En yakalama antikoru seçildikten sonra, tayin tamponu ile 10 ml olduğu antikor-kupleli boncuk stokunun 100 uL (Basamak IB8 itibaren) seyreltik.
- 50 uL eklemeİki Costar yuvarlak tabanlı 96-kuyucuklu plak 78 kuyucuklara seyreltilmiş boncuklar. (78 kuyu x 2 tabak = 156 kuyu) Her plaka farklı bir algılama antikor performansını değerlendirmek için kullanılacaktır.
- 8000 de başlayan, 12-noktalı bir standart eğri hazırlayın 4 de pg / mL ve bitiş R & D Systems TNF-α standart pg / mL. 78 kuyu / plaka toplam, bir arka plan olarak, deney tamponu, her biri 50 uL altı 50 uL levhalarının her biri için her bir seyreltme çoğaltır, artı altı kuyu ekleyin.
- Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, ışıktan korunan oda sıcaklığında, bir saat boyunca inkübe.
- Birinci plakanın her 78 kuyucuklara ilk tespit antikorun 50 uL ekleyin. İkinci plaka üzerindeki ikinci antikor tespiti için tekrarlayın.
- Bir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalanırken ışıktan korunan oda sıcaklığında, at, 30 dakika süreyle inkübe.
- Her plaka tüm kuyulara SA-PE reaktif 50 uL ekleyin.
- ÜretmekBir test plakası karıştırma cihazı üzerinde, çalkalama ederken, oda sıcaklığında 15 dakika için iki levha, ışıktan korunan.
- Bir dakika için manyetik ayırıcılar plaka üzerine tabak yerleştirin, daha sonra ise ayırıcı üzerinde zorla ters plaka ile sıvı çıkarın.
- Plakalar üzerinde 78 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin; bir dakika için manyetik ayırıcılar plaka üzerine tabak yerleştirin, sonra zorla ters plaka ile sıvı çıkarın.
- Plakalar üzerinde 78 kuyuların her Assay Buffer 100 mcL ekleyin ve düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakarak, MAGPIX cihaz üzerinde analiz.
V. ELISA Testi
- R & D Systems İnsan TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kiti (Ar-Ge Bölüm # DY210) birlikte verilen yönergeleri izleyerek, Ar-Ge kitinde standart tarafından oluşturulan yanıtı ölçmek. R & D Systems yakalama ve algılama karınca yerine, ELISA testi üç kez daha tekrarlayındiğer satıcıların antikorlar ile ibodies. Basitlik, çifti satıcı tarafından antikorlar (örn Millipore algılama antikor ile Millipore yakalama antikor, Abcam algılama antikor ile Abcam yakalama antikor, vb) için.
- Üç TNF-α protein standartları her biriyle gibi ELİSA formatı gereği, birbirinden bağımsız her çifti değerlendirin.
VI. Temsilcisi Sonuçlar
Bu protokol hızla tahlil optimize etmek için teknolojinin multipleks kapasitesini kullanırken diğer yandan da tipik bir ELISA xMAP platformuna dönüştürülebilir gösterilmiştir. Bu örnekte kullanılan ELISA İnsan TNF-alfa (TNF-α) R & D Systems DuoSet ELISA kiti (Ar-Ge Bölüm # DY210) idi.
Kiti içinde sağlanan antikor çifti ek olarak, farklı kaynaklardan (Malzeme tablosu) gelen diğer üç antikoru çiftleri xMAP platformu ile eş zamanlı olarak değerlendirildi. Foantikorların ur yakalama antikor olarak tayin edildi ve MagPlex Düşük Konsantrasyon Mikroküreler akuple edilmiştir. Diğer dört antikorlar tespit antikor olarak tayin edildi; biotin çiftli olarak satın alındı ve Protokol açıklandığı gibi dördüncü biyotinile edildi üçü.
Bu çalışma için antikorlar kullanılabilirliği ve satıcıya göre seçilmiştir. Ancak, pratik ortamda, antikorlar bireysel kullanıcının tercihi ve bu antikor ile geçmiş performansına dayalı deneyim seçilmelidir. Bu deneyde, bir antikor çekimi karşı tespit antikor olarak bir antikorun uygunluğunu test yoktur, ancak bu protokol kolaylıkla bu amaç için değiştirilebilir.
Luminex xMAP deneyleri TNF-α antikoru kupleli MagPlex mikrosferler dört set birleştirerek, bir karışımı gibi, dört yakalama antikorlar değerlendirmek için bir multipleks olarak uygulandı. Yakalama antikorlar dört her değerlendirildibireysel biyotinile algılama antikorlar, dört yakalama antikorların her biri ile bir algılama antikor etkileşimi eş zamanlı olarak tespit edilebilir olduğu gibi. Paralel olarak gerçekleştirilir gibi dört deneyleri, dört yakalama antikorları ile birlikte dört algılama antikorların etkileşimler belirlenir. Şekil 1, bu tarama deneyleri ile karşılaştırmalı verileri gösterir.
Sonuçları R & D Systems DuoSet gelen antikor çifti 6183 Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) birimleri bir sonuçlanan tepki ile en iyi performansı gösterdi. Ayrıca, R & D Systems yakalama antikoru ile bir araya geldiğinde Millipore (R & D antikoru çifti tepkisinin% 86) ve Abcam (% 67) gelen tarama antikorlar, xMAP deneyde, makul bir yanıt sağladığı gözlenmiştir. Abcam, Millipore ve Novus gelen antikorların yakalama xMAP deneyde, bir daha az arzu tepkisi üretilir.
Bu dikkat etmek önemlidir, bu purBu çalışmanın poz belirli antikorlar veya satıcılar arasında farklılıklar ancak sadece benzer koşullar altında kullanılan performans gözlenebilir farklılıklar olduğunu göstermek ve xMAP platformu bu farklılıkları değerlendirmek için etkili bir araç sunabilir için vurgulamak için zorunlu değildir.
R & D Systems DuoSet protokolü bir ELISA biçiminde dört antikor çiftleri karşılaştırmak için kullanıldı. R & D Systems protokolü bugün yaygın olarak kullanılan tipik ELISA protokolleri yansıtıcı çünkü tüm antikor çiftleri kullanılabilir ve xMAP teknolojisi ile kullanılan protokoller paraleldir edildi. ELISA testi R & D Sistemlerinden antikoru çifti daha iyi sonuçlar (Şekil 2) verdi olduğunu gösterdi. Abcam gelen antikor çifti Millipore ve Novus üretilen mütevazı cevaplar hiçbir yanıt ve antikor çiftleri üretti.
Standardı ile antikor reaktivitesi herhangi bir değişiklik değerlendirmek için, tüm dört antibody çifti üç farklı satıcıları (Malzeme tabloya bakınız), üç farklı rekombinant TNF-α protein standartları ile test edildi. Üç satıcılardan rekombinant TNF-α protein standartlarına eşdeğer sonuçlar verdiği Şekil 2 gösterisinde verileri.
R & D Systems, TNF-α proteini ELISA (Tablo 1) ve xMAP deneyleri (Tablo 2 ve 3) ile standart eğri üretmek için kullanıldı. ELISA testi R & D Systems antikor çifti ile yapılırken, xMAP testlerinin R & D Systems veya Millipore gelen R & D Systems yakalama antikor ve algılama antikor ya kullanılmaktadır. R & D Systems, TNF-α proteini 8000 ila 4 pg / ml konsantrasyonlarında bir dizi üretmek için seyreltilmiştir. R & D Systems, sadece antikoru çifti olarak Tablo 2'de gösterildiği gibi, bir yanıt> 20.000 MFI ile xMAP deneyde beklenen sonucu üretilen veŞekil 3. Millipore gelen tarama antikoru R & D Systems algılama antikor yerine (Tablo 3), R & D Sistemlerinden algılama antikoru ile elde edilen yanıt yaklaşık% 30 olan tepkisi (6000 MFI) içinde xMAP Assay ile birlikte kullanıldığı zaman, gösterildiği gibi Şekil 3.
Tablo 1'de veri 16-1000 pg / mL üreticinin tavsiye TNF-α menzili vardı ELISA, standart eğrisi temsil eder. 1000 OD pg / mL 2 OD birimleri biraz daha fazla olduğunu ve spektrofotometre 3 OD yukarıda ölçmek mümkün olduğundan, bu aralık çok sınırlı idi. Çünkü spektrofotometre ile limit, daha da ELISA deneyine aralığında arttırmak mümkün değildi. Buna ek olarak, Tablo 1 in veri R & D Systems DuoSet ELISA 16 pg / ml 'den daha az konsantrasyonlarda TNF-α saptamaya muktedir değildir göstermektedir. Diğer taraftan, xMAP assay sinyal kuv yeteneğine sahiptirR & D Systems ya Millipore ya gelen algılama antikoru ile birlikte R & D Sistemlerinden yakalama antikoru ile birlikte en az 7.8 pg / mL 'lik bir konsantrasyonda ING TNF-α.
(Şekil 4), bir log-log ölçeğinde çizilmiştir zaman her iki yöntemin dinamik aralık ve duyarlılık daha gösterilmiştir. XMAP testlerden ELISA yanıtları ve yanıtlarının eğimi arasında net bir ayrım daha da yüksek ve düşük konsantrasyonlarda hem de ELISA yöntemi ile TNF-α tespiti için daha sınırlayıcı yeteneği gösterir görülebilir.
Iki fonksiyonel TNF-α xMAP deneyleri için algılama (LOD) sınırları bir arka plan daha fazla gözlenen tepki seviyesi (MFI), artı üç kat, standart sapma (SD) ile en düşük, TNF-α konsantrasyonu belirleyerek yaklaştırılır edildi. Istatistiksel anlamlılık ulaşmak için, altı xMAP ve ELISA iki yöntem için SD belirlemek için kullanılmıştır çoğaltır. ThesLOD e tahminleri iyimser ve normal çalışma koşullarında sadece iki veya üç kullanılacak çoğaltır anlayışı ile bir "iyi durum" senaryosu, sağlamak amaçlıdır. Tablo 2 de, bu ölçütleri karşılayan, R & D Systems çifti, 3.91 en düşük TNF-α konsantrasyonu kullanıldığında pg / ml arka + 3SD tepkisi daha büyüktür 66 MFI, bir yanıt üretilen, olduğu görülmektedir . Millipore algılama antikoru R & D Systems Yakalama antikoru (Tablo 3) ile birlikte kullanıldığı zaman, algılama limiti az 7,81 pg / ml olmuştur. Bu durumda, en düşük 2 TNF-α konsantrasyonu 17 MFI kabul edilebilir bir yanıt üretilir; düşük TNF-α konsantrasyonunun büyük müdahale artı üç kez standart sapma. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Benzer şekilde, R & D Systems DuoSet ELISA için algılama sınırının 63 pg / ml ve 31 pg / mL (Tablo 1) olarak tahmin edilmiştir.
Şekil 1. Dört yakalama antikorların olası her kombinasyon için R & D Systems standart (@ 2,000 pg / mL) (dört farklı mikroküre bölgelere birleştiğinde) ve dört algılama antikorların ortalama floresan yoğunluğu (MFI). büyük görmek için tıklayın rakam .
Şekil 2. Dört yakalama ve algılama antikor çifti kombinasyonları için üç farklı rekombinant standartları (@ 1,000 pg / mL) optik yoğunluk (OD). Yakalama ve algılama antikorlar keyfi basitlik için, satıcı tarafından eşleştirilmiş edildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
| pg / mL | OD | Std Dev | +3 SD |
| 1000 | 2.084 | 0.035 | 2.187 |
| 500 | 1.328 | 0.038 | 1.441 |
| 250 | 0.787 | 0.025 | 0.863 |
| 125 | 0.476 | 0.026 | 0.554 |
| 63 | 0.304 | 0.023 | 0.374 |
| 31.3 | 0.212 | 0.025 | 0.287 |
| 15.6 | 0.167 | 0.244 | |
| 0 | 0.118 | 0.021 | 0.182 |
Tablo 1 standart bir eğri olarak kullanmak için R & D Systems DuoSet prospektüste, tarafından belirtilen 2 kat dilüsyon serisinin optik yoğunluk (OD);. 31.3 arasındaki standart sapma (SD) ve algılama tahmin sınırı (LOD) dahil olmak üzere, pg / ml ve 63 pg / ml.
| R & D Systems Yakalama ve Tespit Antikorlar | |||
| pg / mL | MFI | Std Dev | +3 SD |
| 8000 | 20,320 | 463 21,707 | |
| 4000 | 15,594 | 223 | 16,263 |
| 2000 | 11,098 | 79 | 11,336 |
| 1000 | 6,985 | 160 | 7,465 |
| 500 | 4,149 | 80 | 4,390 |
| 250 | 2,233 | 30.0 | 2,323 |
| 125 | 1,199 | 43.8 | 1,330 |
| 63 | 636 | 14.0 | 678 |
| 31.3 | 340 | 12.9 | 379 |
| 183 | 5.9 | 201 | |
| 7.8 | 103 | 2.2 | 109 |
| 3.9 | 66 | 2.4 | 73 |
| 0 | 11 | 0.8 | 13.8 |
Tablo 2, R & D Systems DuoSet ile birlikte antikor çifti kullanılarak xMAP teknolojisi ile ölçülen bir standart dilüsyon serisinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI);. Standart sapma (SD) ve algılama tahmini sınırı (LOD), az 3.91 dahil pg / ml.
| Millipore Algılama Ab R & D Systems Yakalama Ab | |||
| pg / mL | MFI | | +3 SD | |
| 8000 | 5,800 | 143 | 6,229 |
| 4000 | 3,881 | 120 | 4,242 |
| 2000 | 2,176 | 73 | 2,396 |
| 1000 | 1,138 | 32.1 | 1,234 |
| 500 | 578 | 31.3 | 671 |
| 250 | 289 | 6.2 | 307 |
| 125 | 142 | 3.1 | 151 |
| 63 | 75 | 5.3 | 91 |
| 31.3 | 44 | 3.3 | 54 |
| 15.6 | 28 | 2.6 | 35.5 |
| 7.8 | 17 | 1.5 | 21.2 |
| 3.9 | 10 | 2.0 | 16.3 |
| 0 | 7 | 1.4 | 11.4 |
Tablo 3 R & D Systems yakalama antikor ve EMD Millipore algılama antikor kullanarak xMAP teknolojisi ile ölçülen bir standart dilüsyon serisinin ortalama floresan yoğunluğu (MFI);. Standart sapma (SD) ve algılama tahmini sınırı (LOD) dahil olmak üzere, daha az 7.81 'den pg / ml.
Şekil 3. Iki xMAP testleri ve R & D Systems DuoSet ELISA standart eğrileri. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. XMAP standart eğrileri ve log-log ölçeğinde ELISA standart eğrinin karşılaştırılması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüşüm streptavidin fikoeritrin (SA-PE) ile tipik bir ELISA kiti streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) yerine, ve performans için optimize kadar basit olabilir. Kadar yerden bir xMAP immunoassay yaratmak isteyenler için, bu da antikor çiftlerinin hızlı, multipleks değerlendirilmesini sağlar basit bir protokol ile gerçekleştirilebilir. XMAP tayini için reaktifler kolayca çift belirlenmiş yakalama antikorlar MagPlex düşük konsantrasyonda mikrosferler ile xMAP Antikor Kuplaj kiti kullanılarak hazırlandı. Düşük konsantrasyonda mikrosferler kullanımı daha yüksek konsantrasyonda mikrosferler ile aynı test performansı sağlarken assay gelişme maliyetini düşürür. Birleştiğinde MagPlex mikrosferler hazırlamak için gerekli zaman miktarı olan 22 daha hızlıdır, yaklaşık 3 saat - 24 saat tedavi ardından, mont, bir ELISA plaka iyi için gereklikaplamalı kuyuların. XMAP testinin performanslı bir algılama (<4 pg / mL vs> 31 pg / mL) ve dinamik aralık (<4 pg / ml> 8000 pg / mL vs 16 sınırı açısından da ELISA üstündür pg / ml 1000 pg / ml). Plaka okuyucuların bir deney için dinamik aralığı üst sınırını kısıtlayarak, ya 3 ya da 4 OD sınırlı bir OD yelpazesi var.
Kuşkusuz, tüm antikorların ELISA biçimde çalışır ve bir ELISA iyi çalışmamaktadır tüm antikorlar xMAP tahlil formata kolayca aktarılabilir. XMAP testler (aynı anda çalışabilir, yani) çoğaltılmış olabilir beri Ancak, bir deney için kullanılacak en iyi çifti belirlemek için aynı anda birden fazla yakalama ve algılama antikor kombinasyonları değerlendirmek mümkündür. Bu süreç, önemli zaman ve her seferinde bir çiftin değerlendirilmesi ile sınırlıdır ELISA geliştirme prosedürü göre reaktifleri kaydeder. Iki veya daha fazla antikor çiftleri eşdeğer yapmalıdır; testin diğer parametreleri olabilirçift (örneğin, kullanılabilirlik, maliyet, vb) uygunluğunu belirlemek için düşünülebilir.
XMAP tayini ile geliştirilmiş test performans ve esnekliğe ek olarak, önemli maliyet tasarrufları da vardır. Bir xMAP assay of iyi bir kullanılan boncuklar için gerekli miktarı yaklaşık 7.5 ng iken antikor tavsiye edilen miktarı, tek bir kat ve bir ELISA plaka 400ng olduğu için gereklidir. Böylece, bir ELISA için gerekli olan antikor miktarını iyi bir xMAP deneyde kullanılır ise, 50 den fazla test sonuçları sağlayacaktır. Değerli örnekleri içeren uygulamalar için, xMAP ayrıca önemli bir avantajı vardır. XMAP tahlil için gerekli hacminin yarısı veya daha az olabilir, oysa ELISA için önerilen örnek hacmi 100 uL olduğunu.
Üstün dinamik aralık ve duyarlılık ile test üretirken Özetle, Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüştürme, komplikasyonsuz verimli ve maliyet tasarrufu sağlar.
Disclosures
Bu çalışma Luminex Corporation üretilen ekipmanlar ile Luminex Corporation yapıldı.
R & D Systems & EMD Millipore Luminex Corporation'ın stratejik ortakları olan; multipleks xMAP dayalı testler geliştirmek ve ticarileştirmek için lisanslı.
Acknowledgments
Bu çalışma Luminex Corporation tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
