כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em> ג elegans</em

Summary

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה ב<em> ג elegans</em>, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות ללא עיוותים הציג תחזית Z-המטוס בתוך מדגם אחד.

Abstract

עוצמת הסינפסה מתייחס משרעת של תגובות postsynaptic לאירועים presynaptic שחרור הנוירוטרנסמיטר, ויש לו השפעה משמעותית על התפקוד הכללי במעגל העצבי. עוצמת הסינפסה תלויה באופן קריטי שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות באתרים הסינפטיים על קרום postsynaptic. רמות הקולטן מבוססים מבחינה התפתחותית, והוא יכול להשתנות על ידי הקולטן סחר בין בריכות קרקע מקומי, subsynaptic, ו תאיים, המייצגים מנגנונים חשובים של פלסטיות סינפטית neuromodulation ו. שיטות מחמירות לכמת synaptically-מקומי הקולטן שפע הנוירוטרנסמיטר חיוניים ללמוד פיתוח הפלסטיות הסינפטית ו. מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא גישה אופטימלית, כי היא שומרת מידע מרחבי, להבדיל מ – סינפטי לא סינפטיים בריכות, ומפלה בין אוכלוסיות מקומיות הקולטן לסוגים שונים של סינפסות. אורגניזם גנטי מודל Caenorhabditis eleganזה מתאים במיוחד עבור אלה מחקרים בשל גודל קטן הפשטות היחסית של מערכת העצבים שלו, השקיפות שלו, ואת הזמינות של טכניקות גנטיות רבות עוצמה, ומאפשר בחינה של סינפסות דובר בבעלי חיים שלמים.

כאן אנו מציגים שיטה לכימות fluorescently שכותרתו קולטני הנוירוטרנסמיטר סינפטיים ב C. elegans. תכונת המפתח שלה הוא זיהוי וניתוח אוטומטי של סינפסות בודדות בשלושה ממדים רב המטוס confocal פלט קבצים מיקרוסקופ, מיקום tabulating, נפח, עוצמת הקרינה, וכן הקרינה הכוללת של כל סינפסה. גישה זו יש שני יתרונות עיקריים על פני ניתוח ידני של Z-המטוס תחזיות של נתונים confocal. ראשית, כי כל מטוס של סט נתונים confocal כלול, הנתונים לא הולכים לאיבוד דרך הקרנת Z-המטוס, המבוססת בדרך כלל על ממוצעים בעוצמה פיקסל או מקסימה. הזיהוי השני, של סינפסות היא אוטומטית, אבל יכול להיבדק על ידי לשעברperimenter עם התקדמות ניתוח נתונים, המאפשר מיצוי מהיר ומדויק של נתונים מתוך מספר רב של סינפסות. מאות עד אלפי סינפסות לפי המדגם יכול בקלות לקבל, ייצור ערכות נתונים גדולות, על מנת למקסם את כוח סטטיסטי. שיקולים להכנת ג elegans לניתוח, ולבצע הדמיה confocal כדי למזער את השונות בין בעלי חיים בתוך קבוצות הטיפול הם דנו גם. למרות שפותחה לנתח ג קולטנים elegans postsynaptic, שיטה זו היא בדרך כלל שימושית עבור כל סוג של חלבון synaptically, מקומית, או למעשה, כל אות הקרינה, כי הוא מקומי לאשכולות נפרדים, puncta או האברונים.

ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1) הכנת דוגמאות, 2) הדמיה confocal, ו 3) ניתוח התמונה. שלבים 1 ו -2 הן ספציפיות ג elegans, ואילו בשלב 3 הוא בדרך כלל החל על כל אות הקרינה punctate ב micrographs confocal.

Protocol

1. הכנת תולעים הדמיה קטע זה של פרוטוקול מבוסס על פורסם C. טכניקות elegans תרבות 1,2, ו מתואר באיור 1. לגדל תולעים על צלחות peptone גבוהה NGM אגר (10 ס"מ) עם זרע NA22 א &#39…

Discussion

השיטה המוצגת כאן נועדה לחלץ כמותיים רב פרמטרים הנתונים על אוכלוסיות גדולות של סינפסות ב C. elegans, תוך מיקסום עקביות בתוך קבוצות הטיפול. שלוש תכונות לתרום יעדים אלה. ראשית, immunostaining מבוצע על אוכלוסיות תולעת סינכרוני על מנת להבטיח כי כל בעלי החיים הם בני אותו גיל. שלב ?…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.