Summary
neurotransmitter है synapses पर क्लस्टर रिसेप्टर्स की बहुतायत जोरदार synaptic शक्ति को प्रभावित करती है. इस विधि के तीन आयामों में fluorescently लेबल neurotransmitter रिसेप्टर्स quantifies के में एकल गुणसूत्रीयसंयोजन संकल्प के साथ
Protocol
1. कीड़ों की इमेजिंग के लिए तैयार
प्रोटोकॉल के इस खंड प्रकाशित सी. पर आधारित है एलिगेंस संस्कृति 1,2 तकनीक है, और चित्रा 1 में उल्लिखित है.
- उच्च peptone एन जी एम अगर प्लेट वरीयता प्राप्त (10 सेमी) पर NA22 ई. के साथ कीड़े बढ़ने कोलाई बैक्टीरिया तक लगभग भूखे. Immunostaining अगर, एक प्लेट मज़बूती से 1 दाग व्यक्ति के लिए पर्याप्त कीड़े का उत्पादन होगा, खाते के घाटे में जिस तरह से अपने साथ ले, और सख्त मापदंड इमेजिंग के लिए कीड़े (पार्ट 2) का चयन किया.
- 2 DDH 0 की प्लेट पर कुछ मिलीलीटर गिरने से फसल कीड़े, संक्षेप में घूमता है, और एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब (दोहराने अगर ट्यूब कीड़े का सबसे हस्तांतरण के लिए आवश्यक) में तरल डालने का कार्य है. 3 मिनट, 1000x जी के लिए नैदानिक अपकेंद्रित्र में गोली. गोली 1-3x DDH 2 हे के साथ जब तक सतह पर तैरनेवाला से अवशिष्ट बैक्टीरिया को दूर करने के लिए स्पष्ट है धो. Polypropylene हस्तांतरण pipettes का उपयोग करने के लिए supernatants हटाने, कीड़े के रूप में गिलास से चिपके रहते हैं(इस कदम से आगे यह करने के लिए कदम के बीच समय लिए अंडा व्यवहार्यता में नुकसान से बचने के कम से कम महत्वपूर्ण है).
- पिछले धोने के बाद, resuspend कीड़ा गोली 5 मिलीलीटर alkaline हाइपोक्लोराइट समाधान में कीड़े और रिहाई अंडे lyse. धीरे रॉक, और एक बार के बारे में प्रति मिनट एक विदारक खुर्दबीन के नीचे ट्यूब की जांच. जब कीड़े के बारे में 50% (वे मुड़े और खुले टूटा हुआ दिखाई देगा) lysed कर रहे हैं, तो शीर्ष पर अंडे बफर, inverting के कई बार साथ ट्यूब, भरने और 3 मिनट के लिए, 1000x जी के pelleting lysis समाप्त. Lysis समय 5 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए.
- हस्तांतरण विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, और अंडे बफर के साथ गोली 3x धोना.
- मलबे से अलग अंडे, उन्हें DDH 2 हे में 30% sucrose के एक तकिया पर तैरने लगते हैं: 1.4 कदम से अंतिम धोने के बाद, ध्यान से 5 मिलीग्राम 2 DDH 0 में सतह पर तैरनेवाला resuspend और गोली निकालें. DDH 2 हे में 5 मिलीग्राम बाँझ 60% sucrose के जोड़ने के लिए, और मिश्रण अच्छी तरह से. नैदानिक अपकेंद्रित्र में 6 मिनट, 1000x जी के स्पिन. अंडे नवचंद्रक में जमा (वे हाएक बादल उपस्थिति दिया है), जबकि मलबे होगा गोली.
- एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, एक न्यूनतम मात्रा में अंडे चूसना और गैरवरीय एन जी एम अगर प्लेटों के लिए स्थानांतरण. कोई ट्यूब की ओर से पालन अंडे नीचे rinsed होना कर सकते हैं धीरे और स्थानांतरित के रूप में अच्छी तरह से. एक 10 सेमी गैरवरीय विश्लेषण तनाव प्रति थाली के लिए पर्याप्त है.
- रात भर में 20 अंडे (~ 16 घंटा) डिग्री सेल्सियस के साथ गैरवरीय प्लेटें सेते हैं पहले कुछ घंटे के लिए थाली बाहर निकलने के लिए यह थोड़ा कुछ घंटों के लिए बंद ढक्कन को छोड़ कर सूखी है, लेकिन रात भर कवर करने के लिए सुनिश्चित हो.
- अंडे सेने के बाद, एक 15 मिलीलीटर एस बेसल में चोटीदार ट्यूब (कुछ एस मिलीलीटर की थाली के लिए बेसल ज़ुल्फ़, जोड़ने के लिए, ट्यूब में डाल) L1 के लार्वा हस्तांतरण. नैदानिक अपकेंद्रित्र (3 मिनट, 1000x छ), एस बेसल की एक न्यूनतम मात्रा में resuspend, और 10 सेमी एन जी एम अगर प्लेटें NA22 बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त करने के लिए स्थानांतरण में गोली. 2 प्लेटों यहाँ 1.1 कदम से प्रत्येक मूल थाली के लिए प्रयोग करें. सेते हैं जब तक कीड़े वांछित उम्र तक पहुँचने.
- प्रति दिन एक या दो बार संस्कृतियों मॉनिटर. अगर वे खतरा ओ में हैंच भूख से मर, ताजा NA22 प्लेटों को हस्तांतरण. जंगली प्रकार N2 कीड़े के लिए, भुखमरी या कीड़े की लाइन लहर कि थाली भर में चाल के रूप में पशुओं को सामूहिक रूप से भोजन समाप्त क्षेत्र से दूर की ओर पलायन के गठन से पहले है. एक बार यह रूपों, भोजन पूरी तरह से कुछ घंटे के भीतर समाप्त हो जाएगा.
- कीड़े अब Immunostaining या रहते इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं. फिक्सिंग और निलंबन में कीड़े धुंधला इष्टतम है क्योंकि अक्षुण्ण कीड़े की एक बड़ी संख्या आसानी से imaged किया जा सकता है. धुंधला Finney और Ruvkun के प्रोटोकॉल 3-6 पर आधारित प्रक्रियाओं स्थिर दरार प्रक्रियाओं के लिए बेहतर होते हैं क्योंकि कीड़े की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं.
2. Confocal इमेजिंग
- Confocal इमेजिंग के लिए स्लाइड पर कीड़े माउंट. Microliter प्रति कुछ सौ कीड़े के घनत्व को समायोजित करें. में 2% agarose के एक पैड एस - बेसल इमेजिंग दौरान वाष्पीकरण को रोकने के (एक 3 मिलीग्राम एक कट ऑफ 25 गेज सुई के साथ फिट सिरिंज के माध्यम से लागू) वेसिलीन की एक पतली अंगूठी से घिरा है. एक विंदुकएक कवर पर्ची पर कीड़ा निलंबन की कुछ microliters (इमेजिंग रहते हैं कीड़े अगर चतनाशून्य करनेवाली औषधि का उपयोग करें), और कवर पर्ची पर agarose पैड को कम, कीड़े पैड पर समान रूप से फैल.
- इमेजिंग के लिए कीड़े का चयन करें. ± ° 45 (जहां 0 ° सीधे उद्देश्य की ओर उन्मुख मतलब है) की तुलना में जहां ब्याज की synapses उद्देश्य लेंस ओर उन्मुख कर रहे हैं कोई और अधिक की रेडियल विस्थापन के साथ, कीड़े चुनें. इस मूल्यांकन जल्दी से प्रदर्शन करना (कुछ ही सेकंड) photobleaching से बचने. प्रारंभिक संस्कृतियों के पैमाने पर करने के लिए सुनिश्चित करें पर्याप्त कीड़े इन ज्यामितीय मानदंडों को पूरा करने के लिए अनुकूलित है.
- पूरा confocal इमेजिंग नमूना. अपेक्षाकृत फ्लैट नमूनों है कि 14 के बारे में 0.4 माइक्रोन मोटी वर्गों के भीतर घेर लिया जा सकता है सबसे अच्छा परिणाम. उच्च गति, कम संकल्प छवियों (512 x 512 पिक्सल) तेजी से सही डेटा संग्रह के लिए पर्याप्त हैं. Saturating के अत्यधिक संकेत ताकत के साथ डिटेक्टर से बचें, के रूप में इस प्रतिदीप्ति के कारण मूल्यवान समझना होगासंकेत.
3. स्वचालित और Synaptic क्लस्टर व्यक्तिगत की पहचान विश्लेषण
- ओपन बहु TIF confocal Volocity (या अधिक) 4.0 सॉफ्टवेयर (PerkinElmer है) का उपयोग कर खुर्दबीन से आउटपुट फाइल.
- फसल दूर छवि है कि ब्याज की संरचना शामिल नहीं है के क्षेत्रों (छवि -> विस्तारित फोकस -> चयन करने के लिए फसल -> क्रिया -> मुक्तहस्त आरओआई 'उपकरण का उपयोग ब्याज का चयन करें क्षेत्र, चित्रा 2A). नोट, विस्तारित फोकस कंप्यूटर स्क्रीन पर एक प्रक्षेपण z विमान अपने विश्लेषण सहायता का उत्पादन है, लेकिन अंतर्निहित डेटा को प्रभावित नहीं करता, वही चमक और विपरीत समायोजन के लिए सच है, यदि आवश्यक हो तो).
- लाइन उपकरण का उपयोग का विश्लेषण क्षेत्र की लंबाई को मापने के. रेखा की लंबाई और गणना की जाएगी और डेटा तालिका (चित्रा 2B) करने के लिए जोड़ा है.
- फिल्टर (माप मोड) तीव्रता द्वारा ऑब्जेक्ट्स का उपयोग कर वस्तुओं की पहचान. एक ऐसी सीमा कि synaptic समूहों को निर्दिष्ट करेंप्रकाश डाला और गैर synaptic पृष्ठभूमि (चित्रा -2) नहीं है. एक स्वतंत्र synaptic मार्कर एक और रंग के साथ लेबल शामिल असंदिग्ध रूप से synapses के पहचान में मदद कर सकते हैं. ठेठ synapses कुछ से कुछ सौ voxels के लिए सीमा होती है. नियंत्रण नमूने का उपयोग कर एक बार सीमा निर्धारित करें, और बाद के सभी नमूनों के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं. प्रत्येक नमूना thresholding अलग अस्वीकार्य है क्योंकि यह प्रयोगकर्ता के पूर्वाग्रह के लिए संभावित परिचय. ऑब्जेक्ट्स का चयन कर रहे हैं और स्वचालित रूप से सारणीबद्ध (चित्रा 2 डी).
- व्यवस्थित और डेटा निर्यात. 2 या कम voxels की वस्तुओं को हटा दें, क्योंकि इन आम तौर पर कर रहे हैं पृष्ठभूमि specks के. आगे फ़िल्टरिंग द्वारा, या बाद में विश्लेषण के दौरान समाप्त किया जा सकता है. वस्तु आकार 'द्वारा उनके हटाने के नीचे की ओर, फिर से छाँटना डेटा फ़ाइल की सुविधा तो वे सब समूह के साथ होगा. CSV प्रारूप है, जो Microsoft Excel या अन्य स्प्रेडशीट प्रोग्राम्स से खोला जा सकता है में डेटा निर्यात. प्रत्येक छवि एक आउटपुट फ़ाइल पैदा करता है.
- यदि Volocity नरमवेयर अनुपलब्ध है, वैकल्पिक तरीकों को confocal डेटा Z विमान अनुमानों का विश्लेषण करने के लिए (जैसे रेफरी. 7, या पुस्तिका ImageJ विश्लेषण का उपयोग) उपयोग किया जा सकता है, हालांकि 3 आयामी जानकारी खो दिया है (चर्चा देखें) है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
मात्रा का ठहराव प्रस्तुत विधि अलग चमक और विभिन्न संस्करणों के क्लस्टर आबादी के बीच भेद करने में सक्षम होना चाहिए. चित्रा 3 में प्रस्तुत प्रतिनिधि छवियों और इसी मात्रात्मक डेटा के इन मानकों के आधार पर भेदभाव के उदाहरण प्रदर्शित करता है. एक सामान्य नियम के रूप में परिणाम के अनुरूप होना चाहिए क्या नेत्र करने के लिए स्पष्ट है. UNC 49 GABA सी. के उदर तंत्रिका कॉर्ड Immunostaining के रिसेप्टर के मामले में एलिगेंस, सभी जानवरों को आम तौर पर आकार और परिपक्वता में बहुत समान दिखाई दिया, और पांच कीड़े के एक समूह (तंत्रिका कॉर्ड की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए सामान्य) के लिए कुल synaptic प्रतिदीप्ति मूल्यों मानक त्रुटि से पता चला है मतलब 4 के बारे में 10% के मूल्यों. आनुवंशिक उत्परिवर्तन और अन्य प्रयोगात्मक उपचार (जैसे दवा जोखिम) न केवल मात्रा और तीव्रता मूल्यों आवृत्ति और synaptic समूहों के वितरण में परिवर्तन हो सकता है, लेकिन संभवतः समय पाठ्यक्रम और कीड़े की synchrony विकास, उच्च परिवर्तनशीलता के लिए अग्रणी. हालांकि मात्रात्मक परिणाम हमेशा प्रतिबिंबित नेत्रहीन और नहीं तो क्या सराहना की जा सकती है, जहां त्रुटि उत्पन्न हुई और सुधारात्मक कार्रवाई फिर से thresholding या artefactual वस्तुओं को हटाने के रूप में इस तरह के सुझाव देते हैं प्रकट करना चाहिए Volocity द्वारा की पहचान की छवियों और वस्तुओं का निरीक्षण करना चाहिए.
आकृति 1. तुल्यकालिक सी. की तैयारी एलिगेंस संस्कृतियों तुल्यकालिक संस्कृतियों इस प्रक्रिया से प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि सी. एलिगेंस विकास गिरफ्तारी और भोजन के अभाव में L1 के लार्वा मंच है, और फिर जब भोजन शुरू की है.
चित्रा 2. Synaptic puncta के quantitation.
- छवि के बाहरी क्षेत्रों के लिए फ़ाइल आकार को कम करने और विशिष्टता वृद्धि उत्पन्न होते हैं. बाएं हाथ पैनल छवि शुरू से पता चलता है, मध्यम पैनल के चयनित क्षेत्र से पता चलता है, सही पैनल फसल के बाद छवि से पता चलता है. रेड सिग्नल UNC 49 GABA रिसेप्टर immunofluorescence है, हरी झंडी (presynaptic मार्कर) synaptobrevin - GFP के presynaptic GABA 4 न्यूरॉन्स में व्यक्त की है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
- एक लाइन तंत्रिका कॉर्ड विश्लेषण किया जा खंड की लंबाई तैयार की है, और इसकी लंबाई स्वचालित रूप से परिणाम तालिका में दर्ज की गई है. इस जानकारी को synaptic analyzable तंत्रिका कॉर्ड की लंबाई, जो कई गुना भिन्न अगर कीड़े धुंधला दौरान खंडित हो सकता है की वजह से डेटा मानक के अनुसार करने के लिए आवश्यक है.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "लक्ष्य =" _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- एक सीमा के लिए व्यक्तिगत synaptic समूहों की पहचान के लिए लागू किया जाता है. वाम पैनल thresholding से पहले छवि को दर्शाता है, अलग thresholding स्तर के उदाहरण अलग पैनल (हरी झंडी लोप) में दिखाए जाते हैं. प्रत्येक वस्तु की पहचान की है एक रंग का क्षेत्र के रूप में छवि में दिखाया गया है. बाएं सबसे पैनल में नेत्रहीन स्पष्ट synaptic समूहों और सही सबसे पैनल पर रंग क्षेत्रों के बीच पत्राचार का नोट. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
- प्रत्येक वस्तु की पहचान अलग परिणाम तालिका में सूचीबद्ध है. व्यक्तिगत वस्तुओं, चुना जा सकता है और निरीक्षण के लिए अगर वांछित छवि पर प्रकाश डाला. ध्यान दें कि तालिका (rhodamine ') लाल और हरे रंग (EGFP') चैनलों के लिए जानकारी, ग्रीन चैनल जानकारी संभावित गुमराह कर रहा है के बाद से वस्तुओंकड़ाई से लाल प्रतिदीप्ति पर आधारित पहचान की. यह विश्लेषण भी एकल रंग छवियों पर प्रदर्शन किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 3. प्रतिनिधि जंगली प्रकार सी. से. परिणाम प्रतिनिधि micrographs पहले-UNC 49 GABA रिसेप्टर्स के लिए दाग एलिगेंस (ए) और (बी) के साथ इलाज muscimol, एक GABA रिसेप्टर agonist है कि रिसेप्टर्स के कारण लंबे समय तक प्रदर्शन के बाद downregulated बन के बाद. पैनलों (बाएं) से पहले और thresholding (दाएं) और छोटे पृष्ठभूमि specks को हटाने के बाद फसल छवियों को दिखाने के. (सी) में दिखाया नमूनों के लिए मात्रात्मक synaptic मापदंडों का भूखंड (ए) और (ख): कुल प्रतिदीप्ति तंत्रिका कॉर्ड लंबाई (बाएं), और व्यक्ति गुणसूत्रीयसंयोजन प्रतिदीप्ति सामग्री का संचयी प्रायिकता histograms (मध्य) और synapse (मात्रा righ सामान्यीकृतटी), synaptic सामग्री और मात्रा में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी agonist के जोखिम (अनुपचारित, n = muscimol - इलाज के लिए 115 synapses के लिए n = 60 synapses के द्वारा प्रेरित प्रदर्शन, पी <.001, Kolmogorov के स्मिर्नोव परीक्षण http://www.physics.csbsju .edu / / आँकड़े एस test.html ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
विधि यहाँ प्रस्तुत करने के लिए सी. में synapses की बड़ी आबादी के लिए मात्रात्मक बहु - पैरामीटर डेटा निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है एलिगेंस, जबकि उपचार समूहों के भीतर अधिकतम स्थिरता. तीन सुविधाओं को इन उद्देश्यों के लिए योगदान करते हैं. सबसे पहले, Immunostaining तुल्यकालिक कीड़ा आबादी पर किया जाता है करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी जानवरों को एक ही उम्र के हैं. यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि अभिव्यक्ति के स्तर का विकास विनियमन प्रयोगात्मक उपचार के प्रभाव अस्पष्ट हो सकता है (उदाहरण के लिए UNC 49 GABA रिसेप्टर immunofluorescence के दौरान कई गुना बदलता है विकास (लालकृष्ण डेविस एट अल., तैयारी में)). इसके अतिरिक्त, permeabilization और निर्धारण अत्यधिक परिवर्तनशील हो, मात्रात्मक तुलना कठिन बना सकते हैं. सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों का प्रयोग इस निहित परिवर्तनशीलता कम से कम तकनीक की विश्वसनीयता में सुधार. इस परिवर्तनशीलता को संबोधित करने के लिए अन्य तरीके एक असंबंधित लक्ष्य है कि स्वतंत्र रूप से एक आंतरिक के रूप में देखे जा सकते हैं एक दूसरे एंटीबॉडी का उपयोग शामिल हैpermeabilization के लिए नियंत्रित करने के लिए, या इमेजिंग रहते हैं कीड़े, जो कुल मिलाकर permeabilization के लिए की जरूरत से बचा जाता है में प्रोटीन GFP टैग. हालांकि यह बाद दृष्टिकोण नई समस्याओं परिचय क्योंकि अंतर्जात प्रोटीन अब सीधे, ताकि संभावित transgene संख्या / अभिव्यक्ति की नकल, GFP, या गैर शारीरिक transgene अभिव्यक्ति के स्तर के विलय की वजह से संरचनात्मक परिवर्तन में विसंगतियों के कारण कलाकृतियों है मापा जा करने की आवश्यकता है माना जाता है. कोई एक विधि सही है, आदर्श, corroborating डेटा एकाधिक दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, स्टार्टर संस्कृतियों के आकार लिए confocal विश्लेषण के लिए तय की और दाग कीड़े के लिए पर्याप्त संख्या में परिणाम के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. कीड़े की बड़ी संख्या की आवश्यकता है क्योंकि ज्यामितीय इमेजिंग के लिए कीड़े का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया मानदंड सख्त हैं, जो प्रोटोकॉल की दूसरी विशेषता परिवर्तनशीलता को कम है. एक ही शारीरिक संरचना प्रत्येक जानवर में imaged किया जाना चाहिए (या तो सबसे biologically प्रासंगिक साइट, या एकब्याज की प्रोटीन का व्यापक ऊतक वितरण के मामले में मनमाने ढंग से साइट को चुना), और है कि संरचना के दोनों ओर के लिए केवल मामूली विचलन के साथ उद्देश्य लेंस की ओर उन्मुख होना चाहिए. इस कसौटी ऊतक कि बिखराव उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश, सिग्नल की शक्ति को प्रभावित कर सकते हैं बीच की राशि में परिवर्तनशीलता को नष्ट करने के द्वारा स्थिरता में सुधार. यह महत्वपूर्ण है कि कीड़े का चयन किया गया यह एकमात्र कसौटी है, के रूप में यह एक निश्चित परिणाम की उम्मीद के आधार पर परिणाम पूर्वाग्रह के लिए आसान है. वास्तव में सबसे अच्छा प्रयोगों जहां नेत्रहीन संभव प्रदर्शन कर रहे हैं. तीसरी विशेषता यह है कि इस तकनीक की शक्ति के लिए योगदान देता है स्वचालित है और Volocity का उपयोग तीन आयामों में synaptic समूहों की पहचान मात्रात्मक लक्षण वर्णन है. इस विश्लेषण आसान और तेजी से, पहचान और सारणी प्रत्येक प्रायोगिक हालत के लिए व्यक्तिगत synapses के हजारों की सैकड़ों में सक्षम है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, Volocity बहु विमान सी के विमानों के सभी डेटा शामिलonfocal डेटा ढेर, बजाय discarding के डेटा 2 - आयामी पहले प्रोटोकॉल में प्रयुक्त Z-अनुमानों को उत्पन्न करने के लिए. इस विश्लेषण के बहाव, प्रयोगात्मक समूहों पशु प्रति कुल synaptic प्रतिदीप्ति, synapses के स्थानिक वितरण और संस्करणों, कुल प्रतिदीप्ति, और synapses व्यक्ति के लिए अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति की आवृत्ति वितरण के मामले में तुलना की जा सकती है. इन मानकों में महत्वपूर्ण बदलाव का संकेत synaptic विकास की घटनाओं, विकास और विनियामक प्रोटीन की भूमिका, और synaptic plasticity प्रकट कर सकते हैं.
प्रतिदीप्ति Volocity का उपयोग संकेतों के quantitation permeabilized निश्चित सी. विश्लेषण से परे तंत्रिका जीव विज्ञान में आवेदन किया है एलिगेंस नमूने, किसी भी फ्लोरोसेंट उच्च विपरीत puncta स्थानीयकृत संकेत की मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी किया जा रहा है. इसलिए यह निश्चित ऊतक या किसी भी जीव से कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है. हालांकि, निर्धारण और permeabilization कुल synaptic प्रोटीन जनसंख्या के दृश्य की ओर जाता हैएस की परवाह किए बिना कि क्या वे सतह व्यक्त की, जबकि रिसेप्टर्स के लिए कम से कम, केवल सतह व्यक्त अंश synaptic शक्ति के लिए योगदान देता है. Volocity आधारित विश्लेषण भी सतह व्यक्त आबादी के, गैर permeabilizing निर्धारण की स्थिति में उपयोग किया जाता है प्रदान की यों करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Volocity विश्लेषण भी जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा. कई प्रोटीन डोमेन शटल neuronal संकेतन घटनाओं (उदाहरण के लिए synaptic पुटिका रिहाई 8-10 के दौरान synaptobrevin की carboxy टर्मिनस, या neurotransmitter रिसेप्टर्स की सतह सेल 11 तस्करी के दौरान अमीनो टर्मिनल डोमेन) के दौरान vesicular और अलग पीएच के साथ बाह्य वातावरण के बीच. Fusing पीएच संवेदनशील क्रांतिवृत्त GFP टैग इन क्षेत्रों के लिए इन संक्रमण है कि मात्रात्मक अध्ययन किया जा सकता है एक दृष्टिकोण Volocity आधारित का उपयोग कर के vivo संवाददाताओं से में उत्पादन कर सकते हैं. इसी तरह, में neuropeptide जीन GFP लेबल सघन कोर vesicles के परिणामों के GFP टैगिंग है कि के रूप में de - दागप्लाज्मा 12 झिल्ली के साथ इन vesicles के फ्यूज, Volocity विश्लेषण vivo में विशिष्ट neuropeptide रिहाई के लिए एक परख के रूप में इस संदर्भ में उपयोगी हो सकता है. इन सेटिंग्स में से सभी में Volocity विश्लेषण का लाभ अपनी क्षमता की पहचान करने के लिए तेजी से और synapses के बड़ी संख्या यों सक्षम उनके व्यक्तिगत गुण या जनसंख्या वितरण में सूक्ष्म अंतर सांख्यिकीय दृढ़ता के साथ प्रदर्शन किया है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों ए Benham करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NIH अनुदान NS06747 द्वारा BAB के लिए वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T.
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
