Summary
В этом видео показано, как использовать нейронные микрожидкостных устройством без связи плазмы.
Abstract
В этом видео показано, как использовать нейронные микрожидкостных устройством без связи плазмы. В некоторых случаях это может быть желательно обратимо связь устройств Corning № 1 покровного стекла. Это может быть связано, может быть, плазмы чистых не доступны. В других случаях может быть желательно, чтобы удалить устройство из стекла после культивирования нейронов на некоторые виды микроскопии или для иммунной, хотя это и не нужно, чтобы удалить устройство для иммунной так как нейроны могут быть окрашены в устройстве. Некоторые исследователи, однако, до сих пор предпочитают, чтобы удалить устройство. В этом случае обратимого связывания устройства покровного стекла делает это возможным. Есть некоторые недостатки, не-плазменной связывание устройств в том, что не так плотно в печать не образуется. В некоторых случаях аксонов могут расти в канавки, а не через них. Кроме того, из стекла и PDMS являются гидрофобными, жидкости с готовностью не вводить устройство делает необходимым время от времени, чтобы заставить средства массовой информации и других реагентов в устройство. Жидкости войдут устройства с помощью капиллярного действия, но это занимает значительно больше времени по сравнению с устройствами, которые были плазме связаны. Плазмы чистых создает временные гидрофильные расходы на стекло и устройства, которые облегчают поток жидкости через устройство после склеивания в течение нескольких секунд. Для не-плазмы связаны устройств, поток жидкости через устройства занимает несколько минут. Важно также отметить, что устройства, которые будут использоваться с не-плазменной связи должны быть стерилизованы во-первых, в то время как плазма рассматривается устройства не должны быть стерилизованы перед использованием, поскольку плазма чистого будет стерилизовать их.
Protocol
Подготовка микрожидкостных устройств для культуры клеток нейронов
1) Очистите Corning № 1 24 мм х 40 мм слайдов стекла
- Разрушать ультразвуком стеклах в sonicator водяной бане в течение 30 минут
- Промыть стеклах с 70% этанола
- Вымойте слайды три раза дН 2 O
- Сухой слайдов в капот культуры ткани в течение нескольких часов, предпочтительно быстро
Примечание: У нас есть специальные металлические поддоны, которые мы загружаем с горки. Слайды разделены отдельно и помещены в слоты в этом металле стойки. Затем мы можем разместить эти металлические подносы погрузки в стеклянную посуду, что мы залить водой, поставить в sonicator водяной бане, и разрушать ультразвуком в течение 30 минут. Последующие моет проводятся в этом блюде.
2) Подготовка PDMS устройств
- Вырежьте форму PDMS из кремниевой пластины, пробивки отверстий в литых и PDSM квартале
- Чистая PDMS устройств, сначала дует инертный газ (аргон или азот) через них. Затем с помощью 3M Scotch 471 Марка ленту снять с нее остатки мусора
Примечание: Важно сохранить устройства лицевой стороной вверх. Первоначально, когда мы сокращаем PDMS от кремниевой пластине, стороны в контакте с пластины чистой стороне: она содержит микрожидкостных каналов. Мы стараемся быть осторожными, как, как мы можем, чтобы не повредить устройство, и держать чистым лицом вверх, пока мы не готовы для приклеивания плазмы.
- Автоклав устройств в пластиковые контейнеры
- После автоклавирования, чистая № 1 Corning стеклах и плазменно-лечить устройств с помощью плазмы Harrick бренд чище, www.harrickplasma.com
- Место устройства чистой стороной вниз на стекло.
Теперь устройство плазме связаны с стекло.
3) Покрытие устройства с Поли L-лизин (PLL)
- PLL добавляется также с каждой стороны устройства и разрешено проходить через в следующий хорошо
=> 150 мкл PLL для больших скважин и 30 μ л PLL для небольших скважин. Это не должно быть точным до тех пор, как скважины полном объеме.
Примечание: Если вы посмотрите на устройстве вы увидите 4 скважины: каждые две связаны между собой. Вы хотите поместить PLL в одной скважине, так что она будет проходить через устройство в следующий хорошо.
- Разрешить PLL течь через устройства в течение примерно 10 минут, а затем добавить еще PLL в лунки, чтобы заполнить их
- Место устройства, содержащие PLL в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение минимум 4 часов (на ночь предпочтительнее)
- Вакуумные лишнюю PLL после лечения, но будьте осторожны, чтобы не высосать всю жидкость из устройства
Примечание: Вы не хотите, чтобы ввести пузырьков воздуха в каналах или камеры. Просто вакуум лишнюю PLL в скважинах.
- Добавить автоклавного дН 2 O в каждую лунку по обе стороны от устройства, и позволяет поступать в друга под действием капиллярных сил
На рисунке 1 показана схема микрожидкостных устройств. Обратите внимание, как синий (Сома стороны) подключен и красный (аксонального стороны) связаны между собой. Когда мы говорим, положить PLL, или воду или средства массовой информации, на одной скважине на каждой стороне устройства, что мы имеем в виду, например, это: место 150 мкл автоклавного дН 2 O в одном Синий Ну тогда место 150 мкл из автоклавного дН 2 0 в одну Красной Ну. Воды (или PLL, или СМИ, или клеток) будет проходить через устройства других соответствующих хорошо.
Рисунок 1
Примечание: Обратите внимание, что с этого момента, когда я говорю "место средств массовой информации, клетки, вода или PLL в ТОП скважин", я имею в виду диаграмме выше, где Сома бы слева и Аксоны вырастет до право.
- Аспирируйте от воды (опять же стараясь не полностью удалить все жидкости из устройства), а затем добавить еще 150 мкл из автоклавного дН 2 O к одному из каждого подключенного хорошо и позволить ей течь через к соответствующему хорошо.
- Место устройство, содержащее дН 2 O в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 часа, затем повторите шаг снова вымыть. Вымойте устройств в три раза с дН 2 O в течение одного часа каждый, что является общей.
Примечание: Из-за возможности того, что борат из PLL может поглотить в PDMS, некоторые в Чон Лаборатории рекомендуем инкубации устройств ночь с автоклавного дН 2 O через пару яnitial быстро полосканий. Это будет гарантировать, что все свободные борат будут вымываться из PDMS до погрузки клеток. Если этого не сделать, может быть выпуск бората в средствах массовой информации с течением времени, что может привести к цитотоксичности.
- Добавить нейронных Базальные СМИ (НБМ) с необходимыми факторами (glutamax, B27, PenStrep) на вершину скважин
Примечание: устройства могут быть инкубировали в течение ночи и с покрытием из клетки на следующий день, или инкубировали менее 3-х часов с NMB + факторов, прежде чем покрытие клеток.
Подготовка Нейроны для загрузки в устройства
Мы используем 18 дневного плода коры крысы, что мы либо покупают у компании под названием мозга биты или что готовят здесь на территории кампуса для нас. Мы предпочитаем, чтобы получить свежие ткани.
- Получить 1 плода коры головного мозга (2 куска ткани), хранящихся в Hibernate E
- Возьмите 3 длинных пипеток стекла и огня каждую из них на последовательно меньшие размеры использовании спиртовки
- удаление ткани из спящего режима E с пипеткой стекла и поставить в 2 мл NMB + факторы в стерильные 15 мл трубки.
- Растирание: Использование луковицы и стеклянную пипетку коры передается вверх и вниз от 5 до 10 раз. Затем, в следующий меньший пипетка используется для пипетки вверх и вниз по ткани. Наконец, самая маленькая пипетка используется для пипетки вверх и вниз по ткани. Мы хотели бы убедиться, что Есть нет видимых куски.
Примечание: В последнее время Чон Лаборатории начал сравнения клетки из тканей, хранящихся в Hibernate E к клеткам, которые были изготовлены из ткани изначально относились с 0,125% трипсина в 50% Са + + свободных и Mg + + свободный буфер рассечение. Консенсус в том, что ткани подготовлен с использованием трипсина получить более жизнеспособных клеток, чем ткани помещаются сначала в Hibernate E. Если вы не собираетесь использовать ткани сразу, то вам нужно сохранить ткани в Hibernate Е.
Если вы собираетесь использовать ткань сразу и хотели бы увеличить жизнеспособность, затем обработайте ткань с Трипсин перед механическим растиранием следующим образом: 1) развести 1 мл 0,25% трипсина (Gibco, Invitrogen) с 1 мл Са + + свободный Mg + + бесплатный рассечение буфера (конечная Трипсин = 0,125%) в 15 мл трубки (держать ледяной), 2) место ткани в буфер и инкубировать немедленно при температуре 37 ° С в течение 8 минут, 3) добавляют 10 мл DMEM/10% FBS, чтобы остановить Трипсин реакции и продолжают протокол ниже. - Центрифуга клетки при 1100 оборотов в минуту в течение 1 минуты
- Наддувом СМИ тщательно от осадок клеток
- Добавить 1 мл NMB + факторов гранул и повторно приостановил его с помощью пипетки вверх и вниз
- Pass ресуспендировали клетки самотеком через фильтр для удаления сгустков (BD Сокол ячейки фильтра 40 мкм нейлон)
- Граф и пластины клеток:
- Into микроцентрифужную трубки, добавить 60 мкл NMB + факторами, 20 мкл клеточной суспензии, и 20 мкл трипанового синего затем смешайте
- Добавьте примерно 10 мкл этого раствора до гемоцитометра и считать живые клетки (не голубой)
- Отрегулируйте концентрации до 2,5 - 4,5 x10 6 клеток / мл
Примечание: Как правило, мы получаем концентрации около 2,5 - 4,5 х 106 клеток / мл. в зависимости от объема клетки ресуспендировали в (обычно 1 мл НБМ + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Если ткань была подготовлена с помощью трипсина, выход, вероятно, будет увеличен.
Покрытие устройств
- Датчики (первичные нейроны) в одну лунку устройство
- Пластина 5 мкл на небольшое устройство, и 20 мкл на большом устройстве
Примечание: Вы можете загрузить 10 мкл клеток на верхней части устройства, и 10 мкл на нижней части устройства (половина общего объема), или непосредственно все 20 мкл клеток в верхнем сомный хорошо (5 мкл в верхней сомный хорошо для небольших устройств). - Инкубируйте в течение 10 минут при 37 ° C инкубатор так клетки могут начать приложить
- Добавьте примерно 150/30 мкл факторов NMB + в каждую лунку в зависимости от размера устройства
Примечание: Объемы может варьироваться в зависимости от толщины PDMS. Все, что имеет значение в том, что скважины полном объеме.
Справочная Об использовании устройств без Плазменные Склеивание
Без плазменной обработки, Кристина Вт, техником, кто делает это успешно каждую неделю без плазмы, говорит, что просто загрузить клетки сразу же.
Не забудьте удалить средства массовой информации с обеих скважин на стороне сома (аксон сторона не будет иметь значения, если вы оставите в средствах массовой информации). Это поток жидкости, который позволяет клеткам, чтобы войти в основной канал. Если у вас есть средства массовой информации в колодцах, вы не получите поток жидкости.
Discussion
Здесь мы показали, как использовать нейронные микрожидкостных устройств без необходимости плазмы чище. Мы называем это, как не-плазменной связи.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Cornig No. 1 Cover Glass | Cover Glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
