考虑为今后的临床应用唾液取样,棒棒糖般超滤(LLUF)的探针制作,以适应在人类口腔。直接未消化唾液NanoLC-LTQ质谱分析表明LLUF探头的能力,消除大量的蛋白质和高丰度蛋白,使更多检测低丰度肽。
虽然人类唾液蛋白质和多肽已显示1-2 majorly确定从唾液蛋白的胰蛋白酶消化。土著人的唾液多肽的鉴定没有事先与外源酶消化成为当务之急,因为在人类唾液中的原生肽提供的潜在价值,为诊断疾病,预测疾病的进展,并监测治疗效果。适当的采样是提高土著人的唾液多肽鉴定的关键一步。抽样涉及人类唾液离心去除碎片3-4传统方法可能太费时,是适用于临床使用。此外,通过离心去除碎片可能无法清理,大部分受感染的病原体和去除高丰度蛋白质,常常阻碍了鉴定低丰度多肽。
传统的蛋白质组学方法,PRI共轭玛利莲利用二维凝胶电泳(2-DE)凝胶与凝胶消化能找出很多的唾液蛋白质5-6。然而,这种方法一般是不够敏感的检测低丰度的肽/蛋白质。液相色谱 – 质谱(LC-MS法)为基础的蛋白质组学是一种替代,它可以识别2-DE分离,恕不另行蛋白质。虽然这种方法提供了更高的灵敏度,它一般需要事先样品预分馏7预消化和胰蛋白酶,这使得它难以用于临床。
规避由于样品制备质谱的障碍,我们已经开发出一种技术叫做毛细管超滤(CUF)探针8-11。从我们的实验室数据表明,的CUF探测器能够捕捉各种动物在一个充满活力和微创的方式8微环境的蛋白质在体内 –11。没有离心是必要的,因为通过简单的样品采集过程中撤回注射器负压创建。 CUF探针结合的LC-MS已成功确定了胰蛋白酶消化的蛋白质8-11。在这项研究中,我们创建一个棒棒糖般的超滤(LLUF)探头,可以很容易地适合于人类口腔升级的超取样技术。没有胰蛋白酶消化的LC-MS直接分析表明,人类唾液本国包含许多肽来自各种蛋白质的片段。 LLUF探头采样唾液避免离心,但有效地消除了许多大型及高丰度蛋白。质谱结果表明,许多低丰度肽后,筛选出较大的蛋白质与LLUF探针检测。多步样品色谱分离检测低丰度唾液肽独立。为临床应用,LLUF探头纳入D可以用LC-MS在未来可能被用来从唾液,以监测疾病的进展。
我们已经发现,许多未消化在人类唾液中存在的多肽片段。这些多肽片段是从富含脯氨酸的蛋白,肌动蛋白,α-淀粉酶,α1球蛋白,β球蛋白,histain 1,1角蛋白,粘蛋白7,聚免疫球蛋白受体,satherin,S100A9的各种形式的衍生工具。有可能是未定的切割位点的多肽生产作出贡献的许多因素。例如,一些多肽片段可能是人类唾液中自然存在的。许多与PQ的C-末端肽( 表1和补充表1和2)。富…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生资助研究院(以R01-AI067395-01,R21的-R022754-01和R21-I58002-01)。我们感谢尼迈耶C.手稿批判性阅读的。
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
Blue dextran | Sigma | ||
Nano LC system | Eksigent | ||
C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |