Summary
Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.
Abstract
A pesar de la saliva humana proteoma y peptidome se han revelado 1-2 fueron identificados mayormente de tríptico resúmenes de proteínas de la saliva. Identificación de peptidome indígena de la saliva humana sin digestión previa con enzimas exógenas convierte en un imperativo, dado que los péptidos nativos en la saliva humana proporcionan valores posibles para el diagnóstico de la enfermedad, predecir la progresión de la enfermedad y el seguimiento de la eficacia terapéutica. Apropiado de muestreo que es un paso crítico para la mejora de la identificación de la saliva humana peptidome indígena. Los métodos tradicionales de toma de muestras de saliva humana que implica la centrifugación para eliminar los residuos 3-4 puede ser demasiado tiempo para ser aplicable para su uso clínico. Además, la eliminación de desechos por centrifugación puede ser incapaz de limpiar la mayoría de los patógenos infectados y eliminar las proteínas abundancia de alta frecuencia que dificultan la identificación de peptidome baja abundancia.
Los enfoques convencionales de proteómica que el PRIprimordialmente utilizar la electroforesis bidimensional en gel (2-DE) geles en conjugación con la digestión en gel son capaces de identificar las proteínas de la saliva muchas 5-6. Sin embargo, este enfoque no es generalmente suficientemente sensible para detectar péptidos y proteínas baja abundancia. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) basadas en la proteómica es una alternativa que puede identificar las proteínas sin previo 2-DE separación. Aunque este enfoque proporciona una mayor sensibilidad, se necesita generalmente muestra antes de pre-fraccionamiento 7 y pre-digestión con tripsina, lo que hace difícil para el uso clínico.
Para eludir el obstáculo en la espectrometría de masas debido a la preparación de la muestra, hemos desarrollado una técnica denominada ultrafiltración capilar (CUF) sondas de 8-11. Los datos de nuestro laboratorio demostraron que las sondas CUF son capaces de capturar las proteínas en vivo a partir de diferentes microambientes en los animales de una manera dinámica y mínimamente invasiva 8 -11. N centrifugación es necesario ya una presión negativa creada por simplemente retirando la jeringa durante la recogida de muestras. Las sondas de CUF en combinación con LC-MS han logrado identificar las proteínas tríptico-digeridos 8-11. En este estudio, hemos mejorado la técnica de muestreo de ultrafiltración mediante la creación de una paleta-como ultrafiltración (LLUF) sonda que puede encajar fácilmente en la cavidad oral humana. El análisis directo por LC-MS sin digestión con tripsina mostró que la saliva humana contiene autóctono muchos fragmentos de péptidos derivados de proteínas diferentes. Toma de muestras de saliva con sondas LLUF evitar la centrifugación, pero eliminan eficazmente muchos más grandes y de gran abundancia de proteínas. Nuestros resultados de espectrometría de masas ilustra que muchos péptidos baja abundancia se convirtió detectable después de filtrar proteínas más grandes con sondas LLUF. La detección de péptidos de bajo abundancia de saliva era independiente de la separación de la muestra en varias etapas con la cromatografía. Para la aplicación clínica, las sondas incorporan LLUFd con LC-MS podría ser utilizado en el futuro para controlar la progresión de la enfermedad de la saliva.
Protocol
1. La creación de sondas LLUF
- Las membranas de polietersulfona (2 cm 2) fueron selladas con paletas de polipropileno (triángulo de la Universidad de California en San Diego) por las membranas de encolado con epoxi en las fronteras de paletas. Una membrana cargada negativamente polietersulfona con un peso molecular de corte (MWCO) a 30 kDa fue utilizado.
- Un tubo de teflón de etileno propileno fluorado (diámetro interno / diámetro exterior, 0.35/0.50 cm) se adjunta a una salida del cilindro de una paleta de polipropileno triángulo por lo que la sonda LLUF puede ser conectado a una jeringa de 20 ml.
- Después de remojar la membrana polietersulfona en la saliva humana en una placa de cultivo (50 mm de diámetro), la presión negativa creada por la retirada de una jeringa. La jeringa con presión negativa condujo el proceso de ultrafiltración para el muestreo de las proteínas de la saliva.
- Las sondas se esteriliza con alcohol al 70% durante la noche antes de su uso. Para demostrar el cierre, se coloca las sondas LLUF en una soluciónción que contiene azul de dextrano (50 mg / ml) con una masa molecular medio de 2.000 kDa para 2 h. La ausencia de azul de dextrano en las muestras recogidas indica que no hay fugas desarrollado durante la fabricación de la sonda y de muestreo.
2. Extracción de saliva
- Toda la saliva se recogió a partir de tres voluntarios sanos (dos machos y una hembra de entre 20 y 40) que no tomaban medicamentos, sin signos evidentes de gingivitis o caries 6.
- Después de enjuagar la boca con agua, las muestras de saliva fueron recogidas por escupir, sin estimulación química, en un recipiente enfriado con hielo.
- Todas las muestras se agruparon y se mantuvo en hielo durante el procedimiento de recogida.
- Inmediatamente después de la recolección, la saliva (200 l), se aplicó para el muestreo con sondas LLUF. El muestreo se llevó a cabo en una sala de 4 ° C.
- Proteínas de la saliva (1,0 g / l) con o sin LLUF colección sonda fueron sometidos directamente a nano-LC masa spectrometry análisis sin la digestión con tripsina. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de proteínas Bio-Rad 12.
3. NanoLC LTQ-MS Análisis
- Las muestras de saliva no-digerido (5 l) se cargaron directamente a la columna trampa del sistema Eksigent nanoLC por el inyector automático, utilizando 100% de tampón A. (2% acetonitrile/0.1% de ácido fórmico) El nanoLC estaba on-line, junto con un espectrómetro de masas Finnigan LTQ.
- Después de la carga y de lavado de la muestra, la válvula se cambió y 500 nl / min gradiente lineal fue entregado a la trampa y la columna de separación (10 cm de longitud, 100 m, id en la casa llenas de Synergi 4 micras, C18). El gradiente fue de 0 a 50% de tampón B (80% acetonitrile/0.1% de ácido fórmico) en 45 min.
- Los instrumentos nanoLC LTQ-MS fueron operados en el modo de datos dependiente de Xcalibur. MS / MS espectros de los más fuertes cuatro iones MS encima una intensidad de 1 x 10 5 se recogieron con exclusión dinámicohabilitado y la energía de colisión fijó en 35%.
- Cada muestra se realizará dos veces por el sistema de nanoLC LTQ-EM. Las muestras de tres preparaciones separadas fueron utilizados. Esos péptidos detectables en tres muestras separadas se enumeran en las Tablas 1 y 2 suplementarios. Representante de nanoLC LTQ-MS espectros se ilustra en la Figura 3.
4. Análisis de datos y búsqueda de datos de proteínas
- Cada archivo RAW se convierte en un archivo utilizando mzXML Readw.exe.
- El archivo mzXML fue la entrada en una SEQUEST Sorcerer 2 del sistema y búsquedas en contra de una base de datos generado por el hombre desde el Centro Nacional correspondiente para la Información Biotecnológica (NCBI) de bases de datos utilizando la proteína no enzimática especificidad. La tolerancia de la masa del ión precursor se fijó en 1,5 Da. Una masa molecular de 16 Da se añadió a la metionina de la búsqueda de diferencial para dar cuenta de la oxidación.
- Después de la búsqueda SEQUEST, los resultados fueron filtrados automáticamente, validó und muestra PeptideProphet y ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet estima una probabilidad global (p) una asignación de puntaje que el péptido es "correcto" frente a "incorrecta" sobre la base de las puntuaciones SEQUEST es (Xcorr, ΔCn, Sp., RSP) y la información adicional de cada secuencia de péptido identificado. ProteinProphet calcula una puntuación de probabilidad 0 a 1 para cada proteína sobre la base de péptidos asignados a MS / MS espectros.
- Para minimizar falsas identificaciones positivas se utilizó estrictos criterios de filtro. En primer lugar, el mínimo de corte P puntuación se fija en 0,8 para cualquier péptido aceptada para asegurar error muy baja (mucho menor que 3%) y la sensibilidad razonablemente buena. En segundo lugar, todos los péptidos con> 0,8 puntuación de P deben tener alta correlación cruzada (Xcorr) más bajos al mismo tiempo: 1.9, 2.2 y 3.0 para +1, +2, y la carga 3.
5. La eliminación de las bacterias orales con sondas LLUF
- Para determinar la capacidad de sondas LLUF para eliminar elbacterias de la boca, la saliva antes y después de LLUF sonda de recogida (Sección 3) se extendió sobre placas de agar para la detección de bacterias.
- Las bacterias aerobias se cultivaron en un antibiótico libre de Lauria-Bertani placa de agar (LB) a 37 ° C durante un día.
- Las bacterias anaerobias se cultivaron en una placa libre de antibióticos Brucella agar caldo (BD, Sparks, MD) bajo condiciones anaerobias que utilizan Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante un día.
6. Los resultados representativos
1. La fabricación de sondas de toma de muestras de saliva y LLUF en un entorno imitado por vía oral
Si la saliva de muestreo se puede realizar como chupar una piruleta, el procedimiento se evitará la degradación de la saliva escupido en la 13-14 dispositivos de recolección. Es importante destacar que, también será posible controlar a los pacientes de forma dinámica y localmente de las cavidades orales. Además, si la preparación de la muestra utilizando la saliva se podría simplificar, los clínicos fácilmente facilitar el procedimiento para acelerar su decisión sobre la operación clínica que viene. La espectrometría de masas es una de las técnicas más sensibles para detectar e incluso proteínas de secuencias en un período muy corto de tiempo. Sin embargo, los procedimientos complicados para la preparación de la muestra han obstaculizado la utilización de esta técnica en la clínica. Además, se sabe que el aumento de las proteínas abundancia o proteínas con altos pesos moleculares en muestras clínicas (por ejemplo, amilasa en la saliva) proteínas máscara baja abundancia en el análisis de espectrometría de masas 15-16. Para superar los obstáculos mencionados anteriormente, hemos desarrollado un dispositivo de ultrafiltración piruleta-al igual que el nombre LLUF sondas (Figura 1). Una carga negativa polietersulfona membrana con un MWCO de 30 kDa (Figura 1A, una) se pegó a una paleta de polipropileno (Figura 1a, b). Se coloca delante de la sonda LLUF con la intención de filtrar proteínas más grandes en la saliva. Para imitar el medio ambiente humano por vía oral (Figura 1A, g), Una esponja (Figura 1A, e) se empapó en la saliva en una placa de cultivo (Figura 1A, f). Después de retirar completamente la jeringa (Figura 1A, d), la saliva se filtró comenzó a moverse a lo largo de un tubo conectado (Figura 1A, c), y se recogió.
2. Identificación de la saliva peptidome indígena por nanoLC LTQ-MS
Comparando LC cromatogramas, hemos encontrado cromatogramas distintos de saliva antes y después del muestreo LLUF (Figura 2), lo que indica que hay diferentes composiciones de proteínas en la saliva después del muestreo LLUF. Para determinar las composiciones de proteínas, se emplearon nanoLC-LTQ espectrometría de masas que se sabe que es capaz de péptidos de secuencia rápidamente de una mezcla de proteínas múltiple. Más importante aún, para simplificar la preparación de muestras con fines clínicos, toda la saliva, sin productos químicos o la digestión enzimática se aplicó por nanoLC-LTQ análisis de la EM. Inesperadamente, 131 péptidos quere identificado en la saliva no digerida (Tabla de consulta 1). Estos péptidos son fragmentos derivados de diversas proteínas ricas en prolina, la actina, alfa-amilasa, la globina alfa 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de inmunoglobulina polimérica, satherin, y S100A9. Veintiséis únicos péptidos fueron identificados en la saliva después de la filtración con sondas LLUF (Supplemental Cuadro 2). Estos péptidos son fragmentos principalmente derivados de diversas proteínas ricas en prolina. Los péptidos derivados de proteínas tales como el receptor de inmunoglobulina polimérica (83,24 kDa) y la alfa-amilasa, fueron indetectables, lo que demuestra la capacidad de sondas LLUF en la eliminación de las proteínas más grandes y abundantes. Un espectro MS / MS del péptido PFIAIHAEAESKL correspondiente a un péptido interno de alfa-amilasa se ilustra en la Figura 3A. Lo más desconcertante es, después de la eliminación de proteínas más grandes, 18, de 26 péptidos secuenciados se detecta en la LLUF la sonda en la muestra de saliva (Tabla1). Estos 18 péptidos fueron derivados de proteínas ricas en prolina o proteínas hipotéticas que terminaron con una prolina (P) -. Glutamina (Q) (-PQ),-SR, SP-o-PP C-terminal Figura 3B muestra un MS / MS espectro del péptido PQGPPQQGGHPRPP que se detectó en el LLUF sonda en la muestra de saliva. El péptido puede ser derivado de prolina proteína rica subfamilia HaeIII 1 y 2 (Tabla 1).
Figura 1. Las composiciones de sondas LLUF y muestreo de toda la saliva de imitar la cavidad oral humana Panel A: (a) una polietersulfona semipermeable con un MWCO de 30 kDa, (b) una paleta de polipropileno, (c) un tubo de teflón fluorado de etileno propileno; (d) una jeringa de 20 ml Panel B:. una esponja (e) (una lengua imitada) se empapó en una placa de cultivo (f) que contiene la saliva humana para crearuna artificial cavidad oral humana (g). La presión resultante negativa creada por retirarse completamente una jeringa impulsa el líquido recogido para mover a lo largo de un tubo conectado (flecha) y hacia un espacio creado (punta de flecha) dentro de la jeringa. Bar: 2,0 cm.
Figura 2. Diferencial de LC / MS / MS cromatogramas de saliva antes y después del muestreo. LLUF proteínas (1,0 g / l) en la saliva humana entera se filtraron, sin o con una sonda LLUF. Las proteínas sin digestión tríptica fueron sometidos directamente a nanoLC-LTQ MS que se conjugó con un sistema Eksigent nano LC como se describe en Materiales y Métodos. Los cromatogramas de pico de base (con tiempos de retención 44-mim) de saliva antes (A) y después (B) de muestreo LLUF se ilustra.
Figura 3. Detección de la saliva por peptidome nanoLC-LTQ proteínas de la saliva MS secuenciación. antes (A) y después (B) de muestreo con sondas LLUF se analizaron por nanoLC-LTQ MS como se describe en los procedimientos experimentales. Peptidome saliva derivado de la saliva humana natural sin digestión tríptica se demostraron en las Tablas 1 y 2 suplementarios. Un péptido (PFIAIHAEAESKL) derivado de alfa-amilasa se detectó exclusivamente en una muestra de saliva sin colección con sondas LLUF (A), que ilustra que la capacidad de sondas LLUF en la eliminación de grandes proteínas. Muchos péptidos con-PQ,-SR,-SP-PP o C-terminales fueron únicamente en muestras después de sondas LLUF ultrafiltración. Un (PQGPPQQGGHPRPP) de péptidos derivados de diversas proteínas ricas prolina se muestra (B). MS / MS espectros con características "y" y "b" de la serie iones confirmado la identidad de ambos péptidos.
<strong> Figura 4. La eliminación de las bacterias orales que usan sondas durante LLUF. Una sonda LLUF se construyó como se describe en Materiales y métodos. La sonda se coloca en la saliva humana dentro de un entorno imitado por vía oral (Figura 1). La jeringa al final de LLUF sonda fue retirada para crear una presión negativa que condujo el proceso de ultrafiltración para el muestreo de saliva. Durante el muestreo, toda la saliva cruzado selectivamente a través de la membrana polietersulfona y acumulado en el interior de una jeringa. Toda la saliva antes de la toma de muestras con una sonda LLUF sirvió como control. La saliva (10 l) antes y después LLUF sonda de muestreo se extendió sobre placas de agar para la detección bacteriana Panel A:. Saliva con (+ LLUF) y sin (+ LLUF) LLUF sonda de muestreo se extendió de lado a lado sobre un antibiótico libre placa de agar LB a 37 ° C durante un día el Panel B:. La saliva con y sin LLUF sonda de muestreo se extendió sobre una placa de libre de antibióticos Brucella agar caldo debajo condiciones anaeróbicas usando Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante un día. Las bacterias no crecen en placas de agar se propagan con LLUF la sonda en la muestra de saliva, lo que demuestra la capacidad de las sondas LLCF en la eliminación de aeróbica, así como las bacterias anaerobias orales. Bar: 1,0 cm.
| Secuencia del péptido / péptido masa medido | Número de la accesión | Nombre | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | gi | 41349484 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores |
| gi | 41349482 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de | ||
| gi | 60301553 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 |
| gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | gi | 37537692 | Prolina ricos en proteína precursora subfamilia BstNI 4 |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | gi | 113423660 | PREVISTO: proteína hipotética |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | gi | 113423262 | PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5 |
| gi | 41349482 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia una isoforma un precursor de | ||
| gi | 60301553 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2 | ||
| gi | 113423663 | PREVISTO: proteína hipotética | ||
| gi | 41349484 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores | ||
| gi | 41349486 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI un precursor de la isoforma 3 | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | gi | 113423660 | PREVISTO: proteína hipotética |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi | 113423663 | PREVISTO: proteína hipotética |
| gi | 41349482 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de | ||
| gi | 113423262 | PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5 | ||
| gi | 60301553 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia |
| gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia |
| gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 |
| gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | gi | 113423262 | PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5 |
| gi | 113423663 | PREVISTO: hyproteínas pothetical | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia |
| gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | gi | 4826944 | Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2 |
| gi | 9945310 | Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | gi | 113423262 | PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5 |
| gi | 41349482 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de | ||
| gi | 60301553 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2 | ||
| gi | 113423663 | PREVISTO: proteína hipotética | ||
| gi | 41349484 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores | ||
| gi | 41349486 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI un precursor de la isoforma 3 | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | gi | 113423663 | PREVISTO: proteína hipotética |
| gi | 41349482 | Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de | ||
| gi | 113423262 | PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5 | ||
| gi | 60301553 | Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | gi | 37537692 | Prolina ricos en proteína precursora subfamilia BstNI 4 |
Péptidos Tabla 1. Eran exclusivamente detectables en las muestras recogidas LLUF.
Tabla de consulta 1. Haga clic aquí para ver la tabla suplementaria 1 .
Tabla de consulta 2. Haga clic aquí para ver la Tabla 2 suplementario .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemos encontrado que muchos fragmentos peptídicos existen en la saliva humana sin digerir. Estos son fragmentos de péptidos derivados de las diversas formas de proteínas ricas en prolina, la actina, alfa-amilasa, la globina alfa 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de inmunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Podría haber muchos factores que contribuyen a la producción de péptidos con sitios de escisión indeterminados. Por ejemplo, algunos fragmentos peptídicos pueden ser naturalmente presente en la saliva humana entera. Muchos péptidos con PQ-C-terminal fueron identificados (Tabla 1 y los cuadros complementarios 1 y 2). Proteínas ricas en prolina se pueden clasificar como proteínas ácidas, básicas o glicosilada y se codifican por seis genes agrupados en una sola región 17. Más de treinta diferentes proteínas ricas en prolina resultado de la variación alélica, empalme diferencial de ARN, procesamiento proteolítico y modificaciones post-traduccionales 17. Después de la secreción, la ácida rica en prolina Proteins rápidamente se adjunta a las superficies de los dientes y degradadas en los posibles péptidos inmunidad innata por proteolisis la placa dental 18-19. Tanto las bacterias gram negativas y gram-positivos expresar una variedad de glicosidasas y proteasas 18. Se ha informado de que ácidos proteínas ricas en prolina puede ser degradado en potenciales innata-como la inmunidad-péptidos por vía oral Streptococcus y especies de Actinomyces 18. La glutamina (Gln) - glicina (Gly) escisión es biológicamente crítico con respecto a la degradación bacteriana de las proteínas salivares ácidos prolina ricos y la producción de una bacteria de unión-PQ C-terminal 18, 20-22. La unión de PQ-terminales de proteínas ricas en prolina a las bacterias fue confirmada por un experimento in vitro utilizando un pentapéptido sintético RGRPQ 18. De acuerdo con nuestros datos, el grupo de SJ de Fisher fue capaz de identificar varios péptidos con PQ-C-terminal en la saliva humana sin digerir parótida 23,lo que sugiere varios péptidos con PQ-C-terminal puede autóctono existen en toda la saliva humana. La saliva humana contiene péptidos con múltiples PQ-C-terminales que pueden funcionar como innata, la inmunidad, como los péptidos 18, 19. Cuando las bacterias orales están presentes, proteínas ricas en prolina instante puede degradarse a diversos fragmentos con PQ-C-terminal con el fin de matar a las bacterias de manera eficiente.
Otra razón para fragmentos peptídicos existentes en la saliva no digeridos son que algunas de las proteasas endógenas presentes en toda la saliva puede permanecer activa durante la preparación de muestras 24-25. La escisión produce en estas proteínas por proteasas endógenas en la cavidad oral probable continuó antes del análisis de espectrometría de masas. Por ejemplo, la mucina puede ser escindida por la proteasa de la saliva hasta una forma más pequeña que sea más competente en la eliminación de bacterias 26. También es posible que las proteasas de las bacterias orales puede escindir las proteínas orales antes o después de la saliva Collection. Se ha documentado que varias proteínas de saliva puede ser cortada por proteasas de oral, Streptococcus y Actinomyces especies de 27-29.
La membrana semipermeable es un componente clave de sondas LLUF. La membrana es necesario para eliminar selectivamente grandes sustancias incluidas las proteínas, las bacterias orales y escombros. LLUF actúa como una barrera selectiva que permite el paso de ciertos componentes y rechaza otros componentes dentro de una cavidad bucal artificial. La membrana semipermeable permite molécula pequeña para pasar a través de la membrana mientras que excluye macromoléculas. Datos recientes de nuestro laboratorio mostraron que las sondas LLUF puede eliminar eficazmente las bacterias orales, tanto aeróbicas como anaeróbicas (Figura 4). Las muestras de saliva antes y después de la recolección con sondas LLUF se extiende sobre antibióticos libres de placas de agar y se incubaron en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Las bacterias no crecen cuando las placas de agar se extendió con LLUF sondamuestreada la saliva, lo que demuestra la capacidad de sondas LLUF en la eliminación de bacterias orales aeróbicas y anaeróbicas. Se realizaron búsquedas en todos los espectros de una base de datos humana que no incluía las bases de datos de proteínas de microbios orales humanos. La identificación del proteoma / peptidome de los microbios orales se convertirá en una base de datos es posible si la proteína completa, con todos los microbios orales se pueden establecer. Un orgánica (polietersulfona) membrana se utiliza para fabricar las sondas LLUF. Aunque la membrana se sabe que tienen un 30 kDa MWCO, el rendimiento de muestreo depende también de otros factores tales como la interacción de proteínas de la saliva a cargas negativas en la superficie de la membrana 30. Los cambios en los valores de pH y temperatura, así como la complejidad de proteínas en la cavidad oral también influyen en el rendimiento de muestreo. Nuestros datos demuestran que 18 eran exclusivamente péptidos presentes en la saliva LLUF la sonda en la muestra (Tabla 1). Los péptidos terminó con-PQ,-SR,-SP o PP-C-terminal son principalmente derivados de prolina-rica plas proteínas. Se ha informado de que la red de carga negativa proteínas ricas en prolina muestra una fuerte adsorción a una superficie cargada negativamente 31.
En resumen, en un intento de detectar grupos específicos de proteínas en el futuro, membranas semipermeables delante de sondas LLUF se puede alterar mediante varios tamaños de poro y los materiales que tienen diferentes cargas superficiales. Por ejemplo, las membranas de nanofiltración con tamaños de poro intervalo de 0,05 micras a 1 nanómetro puede separar virus de muestras de saliva 32. Sondas LLUF también puede aplicarse para controlar la concentración de diversas sustancias tales como glucosa y lactato en muestras de saliva. A pesar de las membranas de ultrafiltración han hecho uso de la separación de proteínas mediante ultrafiltración centrífuga de 33 años, rara vez se han utilizado para recoger las proteínas mediante la aplicación de presión negativa a través de una membrana semi-permeable. Vinculación de las sondas LLUF con el espectrómetro de masas avanzada, como Fourier transform resonancia ciclotrón de iones (FT-ICR) puede permitir la identificación de las proteínas de la saliva intacta 34-35. En particular, el análisis en línea de los patrones dinámicos de la saliva y el proteoma peptidome puede ser vital para la aplicación clínica de las sondas LLUF. Después de la recolección con sondas LLUF, muchos fragmentos de péptidos derivados de proteínas ricas en prolina fueron identificados a partir de la saliva completa sin digerir. Proteínas ricas en prolina puede interactuar con las bacterias orales para influir en el desarrollo de la caries dental 36 y puede ser importante en la protección de las superficies mucosas de la infección viral 37. Además, se ha documentado que la expresión de proteínas ricas en prolina se alteró en los pacientes con artritis reumatoide 38. Estos estudios apoyan firmemente que proteínas ricas en prolina recogidos por las sondas LLUF puede servir como biomarcadores para el seguimiento de varias enfermedades humanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 y R21-I58002-01). Damos las gracias a C. Niemeyer para la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
