Prøveudtagning Menneskelig Indigenous Spyt Peptidome Brug en Lollipop-Like Ultrafiltrering Probe: forenkle og forbedre Peptid Detection for Klinisk massespektrometri
Summary
Betragtning spyt prøver for fremtidig klinisk anvendelse, blev en slikkepind-lignende ultrafiltrering (LLUF) probe fremstillet til at passe i den humane mundhule. Direkte analyse af ufordøjet spyt ved NanoLC-LTQ massespektrometri viste evnen hos LLUF prober til at fjerne store proteiner og høje tæthed proteiner, og med en lav overflod peptider mere detekterbar.
Abstract
Selv humant spyt proteom og peptidome er blevet afsløret 1-2 blev de majorly identificeret fra tryptiske fordøjelser af spyt-proteiner. Identifikation af naturligt forekommende peptidome af humant spyt uden forudgående fordøjelse med exogene enzymer bliver det nødvendigt, eftersom native peptider i humant spyt tilvejebringe potentielle værdier til diagnosticering sygdom, forudsigelse sygdomsprogression, og overvågning terapeutisk virkning. Passende stikprøve er et afgørende skridt til forbedring af identifikation af humane indfødte spyt peptidome. Traditionelle metoder til prøvetagning menneskelig spyt involverer centrifugering for at fjerne snavs 3-4 kan være for tidskrævende at være gældende for klinisk brug. Endvidere kan debris fjernes ved centrifugering være i stand til at rense de fleste af de inficerede patogener og fjerne de høje tæthed proteiner, ofte hindrer identifikation af lav tæthed peptidome.
Konventionelle proteom tilgange, PRIprimært anvender to-dimensional gelelektroforese (2-DE) geler i konjugation med i-gel fordøjelse stand til at identificere mange spyt-proteiner 5-6. Men denne fremgangsmåde er generelt ikke tilstrækkeligt følsomme til at detektere lav hyppighed peptider / proteiner. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) baserede proteomik er et alternativ, som kan identificere proteiner uden 2-DE separation. Selvom denne fremgangsmåde giver en højere følsomhed, er det generelt nødvendigt forud prøve præ-fraktionering 7 og præ-fordøjelse med trypsin, hvilket gør det vanskeligt for klinisk anvendelse.
For at omgå den hindring i massespektrometri på grund af prøveforberedelse, har vi udviklet en teknik kaldet kapillær ultrafiltrering (CUF) sonder 8-11. Data fra vores laboratorium vist, at de CUF prober er i stand til at opfange proteiner in vivo af forskellige mikromiljøer i dyr i en dynamisk og minimalt invasiv måde 8 –11. Ingen centrifugering er nødvendig, eftersom et negativt tryk skabes ved at sprøjte trække under prøveopsamling. De CUF prober kombineret med LC-MS succes har identificeret tryptisk-fordøjede proteiner 8-11. I denne undersøgelse har vi opgraderet ultrafiltreringen stikprøveudtagningsteknik ved at skabe en slikkepind-lignende ultrafiltrering (LLUF) probe, der let kan passe ind i den humane mundhule. Den direkte analyse ved LC-MS uden trypsinfordøjelse viste, at humant spyt udvindes indeholder mange peptidfragmenter afledt af forskellige proteiner. Sampling spyt med LLUF prober undgås centrifugering men effektivt fjernes mange større og høj forekomst proteiner. Vores massespektrometriske resultater viste, at mange med lav hyppighed peptider blev spores efter filtrere større proteiner med LLUF sonder. Påvisning af lav hyppighed spyt peptider var uafhængig af multiple-trin prøve separation med kromatografi. For kliniske anvendelse, indarbejde LLUF sonderd med LC-MS potentielt kan anvendes i fremtiden til at overvåge sygdomsprogression fra spyt.
Protocol
Discussion
Vi har fundet, at mange peptidfragmenter findes i humant ufordøjet spyt. Disse peptidfragmenter er derivater fra forskellige former for prolin-rige proteiner, actin, alfa-amylase, alfa 1 globin, beta-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymert immunoglobulin receptor, satherin, S100A9. Der kan være mange faktorer, der bidrager til produktion af peptider med ubestemte spaltningssteder. For eksempel kan nogle peptidfragmenter være naturligt til stede i humant spyt. Mange peptider med-PQ C-termini, blev identificere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, og R21-I58002-01). Vi takker C. Niemeyer til kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
