Prøvetaking Menneskelig Indigenous Spytt Peptidome Bruke en Lollipop-Like ultrafiltrasjon Probe: Forenkle og forbedre Peptide Detection for klinisk massespektrometri
Summary
Vurderer spytt prøvetaking for fremtidig klinisk anvendelse, ble en lollipop-lignende ultrafiltrasjon (LLUF) sonde fabrikert for å passe i den menneskelige munnhulen. Direkte analyse av ufordøyd spytt ved NanoLC-LTQ massespektrometri demonstrert evne LLUF sonder for å fjerne store proteiner og høye overflod proteiner, og gjør lite tallrike peptider mer synlig.
Abstract
Selv om menneskelige spytt proteomet og peptidome har blitt avslørt 1-2 de ble majorly identifisert fra tryptic oppsummeringer av spytt proteiner. Identifisering av urfolk peptidome av menneskers spytt uten forutgående fordøyelsen med eksogene enzymer blir viktig, ettersom innfødte peptider i human saliva gi potensielle verdier for diagnostisering sykdom, forutsi sykdomsutvikling, og overvåking terapeutisk effekt. Egnet prøvetaking er et kritisk punkt for forbedring av identifisering av menneskelig innfødte spytt peptidome. Tradisjonelle metoder for prøvetaking menneskelig spytt involverer sentrifugering for å fjerne rusk 3-4 kan være for tidkrevende å være aktuelt for klinisk bruk. Videre kan rusk fjerning ved sentrifugering være ute av stand til å rense de fleste av de smittede patogener og fjern de høye overflod proteiner som ofte hindrer identifisering av lav overflod peptidome.
Konvensjonelle proteomikk tilnærminger som prifremst utnytte to-dimensjonal elektroforese (2-DE) gels i konjugering med i-gel fordøyelse er i stand til å identifisere mange spytt proteiner 5-6. Imidlertid er denne tilnærmingen som regel ikke tilstrekkelig følsom for å oppdage lav overflod peptider / proteiner. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) baserte proteomikk er et alternativ som kan identifisere proteiner uten forutgående to-DE separasjon. Selv om denne tilnærmingen gir høyere følsomhet, må det vanligvis før prøven før fraksjonering 7 og pre-fordøyelse med trypsin, som gjør det vanskelig for klinisk bruk.
For å omgå hindringen i massespektrometri grunn prøveopparbeidelse, har vi utviklet en teknikk som kalles kapillær ultrafiltrasjon (CUF) sonder 8-11. Data fra vårt laboratorium viste at CUF sondene er i stand til å fange proteiner in vivo fra ulike microenvironments i dyr i en dynamisk og minimalt invasiv måte 8 –11. Ingen sentrifugering er nødvendig fordi et undertrykk blir skapt ved å sprøyte trekke under prøvetakingen. De CUF prober kombinert med LC-MS har blitt identifisert tryptic-fordøyde proteiner 8-11. I denne studien, oppgradert vi ultrafiltrasjon prøvetaking teknikken ved å opprette en lollipop-lignende ultrafiltrasjon (LLUF) sonde som lett kan passe i den menneskelige munnhulen. Den direkte analyse av LC-MS uten trypsin fordøyelsen viste at menneskelige spytt indigenously inneholder mange peptidfragmenter fra ulike proteiner. Prøvetaking spytt med LLUF sonder unngått sentrifugering men effektivt fjernet mange større og høy individtetthet proteiner. Våre massespektrometrisk resultater vist at mange lav overflod peptider ble påvisbar etter å filtrere ut større proteiner med LLUF sonder. Påvisning av lav overflod spytt peptider var uavhengig av flere trinn prøve separasjon med kromatografi. For klinisk anvendelse, de LLUF sonder innlemmed med LC-MS kan potensielt brukes i fremtiden for å overvåke sykdomsutvikling fra spytt.
Protocol
Discussion
Vi har funnet at mange peptidfragmenter eksisterer i menneskets ufordøyd spytt. Disse peptidfragmenter er derivater fra ulike former for prolin-rike proteiner, aktin, alfa amylase, alpha 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriske immunglobulin reseptoren, satherin, S100A9. Det kan være mange faktorer som bidrar til produksjon av peptider med undetermined kutteseter. For eksempel kan noen peptidfragmenter være naturlig tilstede i menneskelig helhet spytt. Mange peptider med-PQ C-Termini ble iden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, og R21-I58002-01). Vi takker C. Niemeyer for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
