Med tanke på saliv provtagning för framtida klinisk tillämpning, var en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond tillverkas för att passa i den mänskliga munhålan. Direkt analys av osmält saliv genom NanoLC-LTQ masspektrometri visade förmågan hos LLUF prober för att avlägsna stora proteiner och höga proteiner överflöd, och gör låg rikliga peptider mer detekterbar.
Även om mänsklig saliv proteom och peptidome har avslöjat 1-2 de majorly identifieras tryptiska digereringar av saliv proteiner. Identifiering av inhemska peptidome i mänsklig saliv utan föregående uppslutning med exogena enzymer blir absolut nödvändigt, eftersom infödda peptider i mänsklig saliv ge potentiella värden för att diagnostisera sjukdomar, förutsäga sjukdomsutveckling och övervakning terapeutisk effekt. Lämplig provtagning är ett kritiskt steg för förbättring av identifiering av mänskligt inhemska saliv peptidome. Traditionella metoder för provtagning mänsklig saliv innebär centrifugering för att avlägsna skräp 3-4 kan vara för tidskrävande att gälla för klinisk användning. Dessutom kan skräp avlägsnas genom centrifugering inte att rengöra de flesta av de smittade patogener och ta bort de höga överflöd proteiner som ofta hindrar identifiering av låg förekomst peptidome.
Konventionella proteomik metoder som främstligen använda två-dimensionell gelelektrofores (2-DE) geler i konjugation med i-gel-digerering är i stånd att identifiera många saliv proteiner 5-6. Emellertid är denna metod i allmänhet inte tillräckligt känsligt för att detektera låga förekomst peptider / proteiner. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) proteomik är ett alternativ som kan identifiera proteiner utan föregående 2-DE-separation. Även om detta tillvägagångssätt tillhandahåller högre känslighet, behöver den i allmänhet före provet före fraktionering 7 och pre-nedbrytning med trypsin, vilket gör det svårt för klinisk användning.
Att kringgå hinder i masspektrometri på grund av provberedning, har vi utvecklat en teknik som kallas kapillär ultrafiltrering (CUF) sonder 8-11. Data från vårt laboratorium visat att de CUF sonderna har förmåga att fånga proteiner in vivo från olika mikromiljöer i djur i en dynamisk och minimalt invasiva sätt 8 –11. Ingen centrifugering är nödvändig eftersom ett undertryck skapas genom att helt enkelt spruta dra under provtagning. De CUF sonderna kombination med LC-MS har lyckats identifierat tryptisk-nedbrutna proteiner 8-11. I denna studie uppgraderade vi tekniken ultrafiltrering provtagning genom att skapa en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond som lätt får plats i den mänskliga munhålan. Den direkta analysen genom LC-MS utan trypsin-digerering visade att human saliv utvinning innehåller många peptidfragment härstammande från olika proteiner. Provtagning saliv med LLUF sonder undvikas centrifugering men effektivt bort många större och hög förekomst proteiner. Våra masspektrometriska resultat visade att många låg förekomst peptider blev detekterbar efter att filtrera bort större proteiner med LLUF sonder. Detektering av låga peptider överflöd saliv var oberoende av flera steg prov separation med kromatografi. För klinisk tillämpning av LLUF sonderna införlivad med LC-MS skulle kunna användas i framtiden för att följa sjukdomens progression från saliv.
Vi har funnit att många peptidfragment existera i human saliv osmält. Dessa peptidfragment är derivat från olika former av prolinrika proteiner, aktin, a-amylas, alfa 1-globin, p-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriska immunglobulinreceptorn, satherin, S100A9. Det kan finnas många faktorer som bidrar till produktion av peptider med obestämda klyvningsställen. Till exempel kan vissa peptidfragment vara naturligt närvarande i humant helblod saliv. Många peptider med PQ C-terminalerna identifierades <st…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 och R21-I58002-01). Vi tackar C. Niemeyer för kritisk läsning av manuskriptet.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
Blue dextran | Sigma | ||
Nano LC system | Eksigent | ||
C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |