Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for affinitets-tagget rensing av rekombinante proteiner ved hjelp av væske-håndtering robotikk. Denne metoden er generelt gjelder for småskala rensing av løselige Hans-merket proteiner i en high-throughput format.
Abstract
Røntgenkrystallografi er metoden for valg for å oppnå en detaljert visning av strukturen av proteiner. Slike studier må suppleres med ytterligere biokjemiske analyser for å få detaljert innsikt i struktur / funksjon relasjoner. Fremskritt innen oligonukleotid-og gen syntese teknologi gjør storskala mutagenese strategier stadig gjennomførbare, inkludert substitusjon av target rester av alle 19 andre aminosyrer. Gevinst-eller tap-av-funksjon fenotyper så tillate systematiske konklusjoner som kan trekkes, som bidrag Særlig rester til katalytisk aktivitet, protein stabilitet og / eller protein-protein interaksjon spesifisitet.
For å tilskrive de forskjellige fenotyper til arten av mutasjonen - heller enn til varierende eksperimentelle betingelser - er det viktig å rense og analysere proteiner i en kontrollert og reproduserbar måte. Høy gjennomstrømming strategier og automatisering av manuelle protokoller pårobot væske-håndtering plattformer har skapt muligheter for å utføre slike komplekse molekylærbiologiske prosedyrer med lite menneskelig intervensjon og minimale feil priser 1-5.
Her presenterer vi en generell metode for rensing av His-merket rekombinante proteiner i en high-throughput måte. I en fersk undersøkelse, søkte vi denne metoden til en detaljert struktur-funksjon etterforskning av TFIIB, en komponent av basal transkripsjon maskiner. TFIIB er uunnværlig for promoter-rettet transkripsjon in vitro, og er avgjørende for rekruttering av RNA polymerase til en preinitiation kompleks 6-8. TFIIB inneholder en fleksibel linker domene som penetrerer det aktive sete kløft RNA polymerase 9-11. Denne linkeren domenet confers to biokjemisk kvantifiserbare aktiviteter på TFIIB, nemlig (i) stimulering av den katalytiske aktivitet i løpet av 'avbrytende' stadium av transkripsjon initiering, og (ii) ytterligere bidrag tilspesifikk rekruttering av RNA polymerase til preinitiation komplekse 4,5,12. Vi utnyttet high-throughput rensemetode for å generere enkle, doble og triple substitusjon og slettinger mutasjoner innenfor TFIIB linker og til senere å analysere dem i funksjonelle analyser for deres stimulering effekt på den katalytiske aktivitet av RNA polymerase 4. Til sammen genererte vi, renset og analysert 381 mutanter - en oppgave som ville ha vært tidkrevende og arbeidskrevende å utføre manuelt. Vi produsert og analysert proteinene i multiplicates som tillater oss å sette pris på noen eksperimentelle variasjoner og ga oss en klar idé om reproduserbarhet av våre resultater.
Denne metoden tjener som en generisk protokoll for rensing av His-merkede proteiner og har blitt brukt for å rense andre rekombinante proteiner. Det er for tiden optimalisert for rensing av 24 proteiner, men kan tilpasses til å rense opp til 96 proteiner.
Protocol
DEL A: Høy gjennomstrømming vekst av bakterier.
1. Vokse bakterier Overnatting i 2 ml Autoinduksjonen Medium Bruke 24-brønners plater
- Steriliser 24-brønners plater ved microwaving.
- Vaksinere 1,5 ml autoinduksjonen medium (Overnight Express Medium) med fersk vokst bakterielle kolonier eller frosne glyserol aksjer. Vi normalt vaksinere tre brønner per mutant med tre individuelle klonet kolonier. Reserve seks brønner for positive og negative kontroller. For de positive kontrollene vokser vi opp tre wildtype kloner og for de negative kontrollene vi vokser opp 2 kloner som har blitt transformert med et ikke-uttrykkende plasmid. Sjekk for tilstrekkelig sterilisering av platen ved å la en brønn blank for middels eneste kontroll.
- Dyrke cellene i 18 timer ved 37 ° C og rysting ved 250 rpm. Vi bruker lac-induserbar BL21 (DE3) Rosetta 2 celler. Autoinduksjonen medium inneholder en blanding av glukose og laktose. Bakteriene i utgangspunktetmate på glukose og deretter begynne å bruke laktose, som også induserer ekspresjon av de rekombinante proteiner.
- Ta av lokket og plasser platen på robot-plattformen.
DEL B: Robotic rensing av rekombinante proteiner.
2. Klargjør Robotic Platform
Utgjør vaskebuffer bestående av 20 mM imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM tris-acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol, og elueringsbuffer bestående av 0,5 M imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM tris-acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM 2 ZnOAc, 10% glycerol. Disse buffere vil bli brukt for å vaske perlene etter de merkede proteiner har blitt bundet til dem, eller for å eluere proteiner fra kulene, respektivt.
- Utgjør bakteriell fortynningsmiddel (100 ml destillert vann med 15 pl antiskummemiddel reagens). Denne løsningen skal brukeså foreta fortynninger av bakterielle overnatter kulturer for optisk tetthet (A600) målinger. Tilstedeværelsen av antiskummemiddel i fortynningsmiddelet hindrer dannelse av luftbobler som ville forstyrre for plateavleseren målinger.
- Utgjør lysis bestående av 10x FastBreak reagens, 2 ul lysonase per prøve og 15 mM MgOAc 2. FastBreak inneholder en blanding av vaskemidler og salter som bryter bakterielle celleveggene og lette utgivelsen av intracellulære proteiner. Lysonase er en proprietær blanding av lysozym og nuklease. Lysozym bistår i å forstyrre celleveggen og nuklease fordøyer utgitt bakterielle nukleinsyrer.
- Valgfritt: Lag en 6 M guanidin hydroklorid løsning. Noen rekombinante proteiner har en tendens til å holde seg til teflon-belagt pipetteringsutstyr nåler. De guanidin hydrochloride løsning denatures proteiner og vasker dem mer effektivt enn vann som er rutinemessig brukt til å skylle vaskbare robot pipetteringsutstyr tips etter hver step.
- Klargjør BCA (bicinchoninic syre) proteinkvantifisering reagens ved å blande bicinchoninic syreløsning (reagens A) og kobbersulfat-løsning (reagens B): peptidbindinger reduserer Cu 2 + fra CuSO 4 komponent tilstede i BCA reagens til Cu 1 + hvorved mengden av Cu 1 + er proporsjonal til antall peptidbindinger stede i løsningen. I et andre trinn, to molekyler av bicinchoninic syre chelate Cu 1 + som resulterer i en absorbans skift til 562 nm, noe som resulterer i en lilla farge. Fargen reaksjonen er tidsavhengig og vanligvis trenger flere timer til å være endelig. Etter at fargen er stabil i flere timer.
- Fyll troughs eller plater av riktig størrelse og plassere dem i deres pre-tildelt posisjoner på robot-plattformen.
- Plass en 24-brønners plate for guanidin-hydroklorid avfall, to klare 96-brønners plater for OD 600 og absorpsjonsmålinger og en blå 96-brønns plate for the renset proteiner på sine posisjoner på plattformen. Plasser en 96-Deepwell plate på den magnetiske stativet.
- Fortynn MagneHis Ni-partikler som binder proteiner ved å danne chelater med lagets tags 5-fold i destillert vann og fylle dem i perle-røreenheten. Slå røreren på å holde perlene i suspensjon.
- Slå på robot-plattformen og skylle pipetteringsutstyr nåler i flere minutter for å fjerne luftbobler som ellers ville forstyrre pipettering nøyaktighet. De gjenbrukbare pipetteringsutstyr nåler spyles mellom individuelle pipettering trinn. Alternativt kunne engangsspisser brukes. Alle etterfølgende trinn utføres robotically. Robot-protokollen er tilgjengelig på forespørsel.
3. Cellevekst kontrolleres ved Måle OD600
- 10 pl overnatter kultur fortynnes i 90 ul fortynningsmiddel løsning.
- Mål OD 600 for å sikre at bakterien har vokst til lignende tettheter(Figur 1).
4. Cellene er brutt opp for å frigjøre Proteiner og å tillate Bead-binding
- 100 pl av magnetisk Ni-bead suspensjonen fordeles inn i hver brønn av en andre 24-brønns plate.
- 900 ul av hver småskala bakteriekultur blir overført til 24-brønners plate som inneholder kulene. Tilsett 100 pl av den 10x FastBreak / lysonase blanding.
- Den 24-brønns plate overføres til risting plattform for rask risting (800 rpm) i 30 minutter ved romtemperatur. Bakterielle cellevegger blir forstyrret av en kombinasjon av mekaniske krefter og kjemisk handling og rekombinant produserte proteiner frigjøres i løsning. Med sine tilhørighet tags umiddelbart de binde paramagnetiske chelaterende nikkel perler.
5. Perlene vaskes
- Celle-lysater inneholdende de resuspenderte magnetiske perler er overført til en 96-Deepwell plate som er plassert på et stativ med magnetic stenger som glir mellom brønnene. De 96-brønners plater har fått en firkantet kjegleformet bunn som tillater enklere fjerning av supernatanten. Brønnene kan holde mengder opptil 2,1 ml, men er fylt med mye mindre volum. Dette gjør oss i stand til å utføre kraftig risting trinn uten sample kryssforurensning ved sprut.
- Pipettespissene er vasket mellom individuelle pipetteringsutstyr trinn med 6 M guanidin-HCl. Dette trinnet er avgjørende for rensing av TFIIB og andre "sticky" proteiner for å unngå krysskontaminering. Med andre proteiner kan det være tilstrekkelig å skylle nålene omfattende med vann mellom pipetteringsutstyr trinnene.
- De magnetiske stenger av den magnetiske stativet tiltrekke paramagnetiske perler, trekke dem bort fra sentrene av brønnene og lar pipetteringsutstyr nåler fri tilgang til supernatanten. Supernatanten blir kastet.
- 500 pl vaskebuffer først overføres til 24-brønns plate og deretter overført til 96-brønns plate til ensure den fullstendig overføring av kulene. Den 24-brønns plate fjernes fra shaker.
- Annen 500 pl vaskebuffer er tilsatt direkte til 96-brønns plate, er platene overføres til shaker og kraftig ristet i 1 minutt. Platen er flyttet tilbake til det magnetiske stativet og vaskebufferen forkastet.
- Dette trinnet gjentas to ganger og vaskeprosedyren er ferdig ved å fjerne noen buffer rester fra platen.
6. Eluer Proteiner i elueringsbuffer
- 100 pl elueringsbuffer tilsettes til kulene er platene flyttet til shaker og kraftig rystet i 30 minutter ved romtemperatur.
- Platen er flyttet tilbake til shaker og eluatet, som inneholder det rensede rekombinante protein, er overført til en ny plate.
7. Mål Konsentrasjoner av den rensede Proteiner
- 190 ul BCA reagens blanding overføres til en klar 96-brønns plate og 10 pl av den protein tilsatt.
- Etter flere timers inkubering (typisk 5-6 eller over natten), måle absorbans og sammenligne den til BSA-standarder for å bestemme konsentrasjonene av hver av de rensede protein preparater (figur 2).
- De rensede proteiner kan nå brukes for nedstrøms applikasjoner ved passende konsentrasjoner (figur 3).
8. Representant Resultater
Rensing protokollen tilbyr to kvalitetskontroll stadier, eksempler av disse er vist. Vi er i stand til å identifisere og dokumentere potensielle problemer ved bakterievekst stadiet (fig. 1) og senere ved å vurdere utbyttene av det rensede proteiner (figur 2). Vi vanligvis rense proteiner og teste dem i tre eksemplarer. Dette, i kombinasjon med de to kvalitetskontroll trinn, gir oss tillit til at enhver variasjon vi observert i våre funksjonelle analyser skyldes mutant phenotype (figur 3) og ikke forårsaket av eksperimentelle variasjoner eller mislykkede renselser. Rentene innhentet typisk utvalg 50-200 mg og er mer enn tilstrekkelig for ulike funksjonelle analyser.
Figur 1. Histogram av OD målinger av en 24 brønns plate med overnatting kulturer. Tre kloner av seks TFIIB mutant varianter samt av wildtype TFIIB er dyrket. To kloner som bærer et ikke-uttrykkende plasmid og en brønn med middels bare tjene som negative kontroller. OD Målingene viser at det er små variasjoner i vekstratene mellom individuelle kulturer.
Figur 2. Protein utbytter oppnådd fra disse kulturene som bestemmes av en BCA-analysen og bekreftet av SDS PAGE. En av variantene ikke uttrykkes ved høye nivåer. I comkombinasjon med figur 1, kan vi konkludere med at dette ikke var på grunn av differensial cellevekst, men på grunn av protein uttrykket ikke blir indusert riktig.
Figur 3. Representativt resultat av en transkripsjon analysen. Vi målte stimulering aktiviteten TFIIB varianter på produksjon av små mislykkede transkripsjoner av RNAP. Her blir stimulering virkningene av en hele biblioteket av enkelt aminosyresubstitusjoner av TFIIB rester K87 vist. Den høye graden av reproduserbarhet bekreftes av små feilrater. Et eksempel gel viser resultatene av tre mutanter i forhold til wildtype (vekt), negative kontroller (NC) og elueringsbuffer bare kontrollerer er avbildet under.
Discussion
Den automatiserte rekombinant protein rensemetode beskrives her tillater produksjon og rensing av et stort antall av mutante proteiner i en liten-skala format under svært reproduserbare betingelser med minimal menneskelig inngripen. Figurene 1 og 2 viser resultater av systematiske kvalitet-kontroller og eksempler på den renset proteiner. Figur 3 viser at de rensede transkripsjonsfaktorer i dette eksemplet brukes utføre i en svært reproduserbar måte i funksjonelle analyser.
Selv om prosedyren er utviklet for rensing av archaeal TFIIB, er det allment anvendelig for rensing av affinitets-kodede proteiner. Bruken av slike automatiserte rensing protokoller vil dermed vesentlig lette biokjemisk analyse av rekombinante proteiner og vil dermed ytterligere vår forståelse av protein-protein interaksjoner på en skala som er vanskelig å oppnå til manuelt.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) til ROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C.
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
