Vi beskriver en fremgangsmåte for affinitets-tagget rensing av rekombinante proteiner ved hjelp av væske-håndtering robotikk. Denne metoden er generelt gjelder for småskala rensing av løselige Hans-merket proteiner i en high-throughput format.
Røntgenkrystallografi er metoden for valg for å oppnå en detaljert visning av strukturen av proteiner. Slike studier må suppleres med ytterligere biokjemiske analyser for å få detaljert innsikt i struktur / funksjon relasjoner. Fremskritt innen oligonukleotid-og gen syntese teknologi gjør storskala mutagenese strategier stadig gjennomførbare, inkludert substitusjon av target rester av alle 19 andre aminosyrer. Gevinst-eller tap-av-funksjon fenotyper så tillate systematiske konklusjoner som kan trekkes, som bidrag Særlig rester til katalytisk aktivitet, protein stabilitet og / eller protein-protein interaksjon spesifisitet.
For å tilskrive de forskjellige fenotyper til arten av mutasjonen – heller enn til varierende eksperimentelle betingelser – er det viktig å rense og analysere proteiner i en kontrollert og reproduserbar måte. Høy gjennomstrømming strategier og automatisering av manuelle protokoller pårobot væske-håndtering plattformer har skapt muligheter for å utføre slike komplekse molekylærbiologiske prosedyrer med lite menneskelig intervensjon og minimale feil priser 1-5.
Her presenterer vi en generell metode for rensing av His-merket rekombinante proteiner i en high-throughput måte. I en fersk undersøkelse, søkte vi denne metoden til en detaljert struktur-funksjon etterforskning av TFIIB, en komponent av basal transkripsjon maskiner. TFIIB er uunnværlig for promoter-rettet transkripsjon in vitro, og er avgjørende for rekruttering av RNA polymerase til en preinitiation kompleks 6-8. TFIIB inneholder en fleksibel linker domene som penetrerer det aktive sete kløft RNA polymerase 9-11. Denne linkeren domenet confers to biokjemisk kvantifiserbare aktiviteter på TFIIB, nemlig (i) stimulering av den katalytiske aktivitet i løpet av 'avbrytende' stadium av transkripsjon initiering, og (ii) ytterligere bidrag tilspesifikk rekruttering av RNA polymerase til preinitiation komplekse 4,5,12. Vi utnyttet high-throughput rensemetode for å generere enkle, doble og triple substitusjon og slettinger mutasjoner innenfor TFIIB linker og til senere å analysere dem i funksjonelle analyser for deres stimulering effekt på den katalytiske aktivitet av RNA polymerase 4. Til sammen genererte vi, renset og analysert 381 mutanter – en oppgave som ville ha vært tidkrevende og arbeidskrevende å utføre manuelt. Vi produsert og analysert proteinene i multiplicates som tillater oss å sette pris på noen eksperimentelle variasjoner og ga oss en klar idé om reproduserbarhet av våre resultater.
Denne metoden tjener som en generisk protokoll for rensing av His-merkede proteiner og har blitt brukt for å rense andre rekombinante proteiner. Det er for tiden optimalisert for rensing av 24 proteiner, men kan tilpasses til å rense opp til 96 proteiner.
Den automatiserte rekombinant protein rensemetode beskrives her tillater produksjon og rensing av et stort antall av mutante proteiner i en liten-skala format under svært reproduserbare betingelser med minimal menneskelig inngripen. Figurene 1 og 2 viser resultater av systematiske kvalitet-kontroller og eksempler på den renset proteiner. Figur 3 viser at de rensede transkripsjonsfaktorer i dette eksemplet brukes utføre i en svært reproduserbar måte i funksjonelle analyser.
Selv om prosedyren er utviklet for rensing av archaeal TFIIB, er det allment anvendelig for rensing av affinitets-kodede proteiner. Bruken av slike automatiserte rensing protokoller vil dermed vesentlig lette biokjemisk analyse av rekombinante proteiner og vil dermed ytterligere vår forståelse av protein-protein interaksjoner på en skala som er vanskelig å oppnå til manuelt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) til ROJW
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
NaCl | VWR | 27810.295 | |
Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |