ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا<sup> 2 +</sup> المناولة وحجم الميتوكوندريا الغشاء المحتملة والميتوكوندريا. وكما وصفت إجراءات الحصول على قلب عالية الجودة والوظيفية الميتوكوندريا.
الانتقال نفاذية المسام الميتوكوندريا (mtPTP) هي قناة غير محددة التي تشكل غشاء الميتوكوندريا في الداخلية لنقل المواد المذابة مع الكتلة الجزيئية أصغر من 1.5 كيلو دالتون. على الرغم من أن هوية نهائية الجزيئي للمسام لا تزال قيد المناقشة، والبروتينات مثل D cyclophilin، وVDAC ANT تسهم في تشكيل mtPTP. بينما راسخة إشراك افتتاح mtPTP في موت الخلايا 1، تتراكم الأدلة تشير إلى أن mtPTP يخدم دورا الفسيولوجية خلال كا 2 + التوازن الميتوكوندريا 2، والطاقة الحيوية الأكسدة يشير 3.
يتم تشغيل mtPTP الافتتاح كا 2 + مصفوفة ولكن يمكن أن يكون نشاطها عن طريق التضمين عدة عوامل أخرى مثل الإجهاد التأكسدي، ونضوب النوكليوتيدات الأدينين، تركيزات عالية من بي، الميتوكوندريا أو إزالة الاستقطاب الغشاء uncoupling، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة 4. في المختبر، mtPTP يمكن أن يكون افتتاح منظمة العمل ضد الجوعieved عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم + 2 داخل المصفوفة الميتوكوندريا من خلال إضافات خارجية من الكالسيوم 2 + (القدرة على الاحتفاظ الكالسيوم). عندما كا 2 + المستويات داخل الميتوكوندريا التوصل إلى عتبة معينة، ويفتح mtPTP ويسهل كا 2 + الإصدار، تبديد للبروتون القوة الدافعة، وانهيار غشاء المحتملة وزيادة في حجم مصفوفة الميتوكوندريا (تورم) الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الميتوكوندريا الغشاء الخارجي وفقدان لا رجعة فيها وظيفة العضيم.
نحن هنا وصف فحص فلوروميتريك التي تسمح لتوصيف شامل لافتتاح mtPTP في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من 3 معلمات الميتوكوندريا التي يتم تعديلها عند افتتاح mtPTP يحدث: الميتوكوندريا كا التعامل مع + 2 (امتصاص وإطلاق، مقاسا كا 2 + تركيز على المدى المتوسط الفحص)، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، وmitochondrial الحجم. الأصباغ المستخدمة لقياس الكالسيوم 2 + على المدى المتوسط وفحص غشاء الميتوكوندريا المحتملة هي FURA FF، وهي impermeant الغشاء، الذي يخضع لمؤشر ratiometric تحولا في الطول الموجي الإثارة في حضور كا 2 +، وJC-1، وهي الموجبة، ratiometric المؤشر الذي يشكل مونومرات الأخضر أو الأحمر في المجاميع المحتملة غشاء المنخفضة والعالية، على التوالي. يتم قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء من التعليق الميتوكوندريا. منذ مطلوبة عالية الجودة، الميتوكوندريا وظيفية للمقايسة افتتاح mtPTP، وصفنا أيضا الخطوات اللازمة للحصول على حالها، إلى جانب القلب معزولة للغاية وظيفية الميتوكوندريا.
بروتوكول المعروضة هنا يصف الخطوات اللازمة لتقييم التجريبية افتتاح نفاذية المسام الانتقال في قلب معزولة الميتوكوندريا (الشكل 1 والشكل 4): إجراءات عزل الميتوكوندريا قلب الفأر، والضوابط التي تضمن سلامة الجهاز التنفسي وظيفة، المعلمات الميتوكوندريا خلال رصد mtP…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل HL094536 (BJH).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
Fura FF | Invitrogen | F14180 |
JC-1 | Invitrogen | T3168 |
Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |