Spectrofluorometric протокол для измерения проницаемости митохондриальной переход пор отверстие в изолированном сердце мыши митохондрий, представленные здесь. Анализ включает в себя одновременное измерение митохондрий Ca<sup> 2 +</sup> Обработка, мембраны митохондрий и митохондриальной потенциальных объемов. Процедура получения качественных и функциональных митохондрий сердца также описан.
Митохондриальной поры перехода проницаемости (mtPTP) является не определенный канал, который образует на внутренней митохондриальной мембраны для транспортировки растворенных веществ с молекулярной массой менее 1,5 кДа. Хотя окончательное молекулярно личности пор находится в стадии обсуждения, белки, такие как циклофилин D, VDAC и ANT вклад в формирование mtPTP. Хотя участие в открытии mtPTP гибели клеток хорошо известно 1, накапливаются данные свидетельствуют о том, что mtPTP служит физиологическая роль в митохондриальной Ca 2 + гомеостаза 2, биоэнергетика и окислительно-восстановительные сигнализации 3.
mtPTP открытие вызвано матрицы Ca 2 +, но его активность может быть модулированным ряда других факторов, таких как окислительный стресс, аденин нуклеотидных истощение, высокая концентрация Pi, митохондриальной деполяризации мембраны или разобщение, и длинные цепочки жирных кислот 4. в пробирке, mtPTP Открытие может быть ACHieved за счет увеличения концентрации Са 2 + в митохондриях путем добавления экзогенного Ca 2 + (мощность удержания кальция). Когда Ca 2 + уровней внутри митохондрий достигает определенного порога, mtPTP открывает и облегчает Са 2 +, диссипация движущей силой протонов, мембранный потенциал коллапса и увеличение объема митохондриальной матрицы (отек), что в конечном итоге приводит к разрыву внешней митохондриальной мембраны и необратимой потере функции органелл.
Здесь мы опишем флуорометрической анализа, который позволяет всеобъемлющей характеристикой mtPTP открытия в изолированном сердце мыши митохондрий. Анализ включает в себя одновременное измерение от 3 митохондриальных параметров, которые изменяются при открытии mtPTP происходит: митохондриальная Ca 2 + обработка (поглощение и освобождение, измеряемые концентрации Са 2 + в тесте среды), митохондриальный мембранный потенциал, и mitochondrial объеме. Красители, используемые для Ca 2 + измерение в среде анализа и митохондриального мембранного потенциала являются Fura FF, мембранные impermeant, логометрические индикатор, который претерпевает сдвиг длины волны возбуждения в присутствии Ca 2 + и JC-1, катионные, логометрические индикатор, который образует зеленую или красную мономеров агрегатов при низких и высоких мембранного потенциала, соответственно. Изменения в митохондриальной объем измеряется путем регистрации рассеяния света митохондриальной суспензии. С высоким качеством, функциональными митохондрий, необходимых для анализа открытии mtPTP, мы также описываются шаги, необходимые для получения нетронутыми, очень связаны и функциональные изолированного сердца митохондрий.
Протокол, представленные здесь описываются необходимые экспериментальные шаги для оценки проницаемости переход пор открытие в изолированных митохондриях сердца (рис. 1 и 4): процедура выделения мышью митохондрий сердца, дыхательной управления, обеспечения их целост…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана HL094536 (BJH).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
Fura FF | Invitrogen | F14180 |
JC-1 | Invitrogen | T3168 |
Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |