Multi-parameter Måling av permeabilitet Transition pore åpningen i Isolert Mouse Hjerte Mitokondrier
Summary
En spectrofluorometric protokoll for måling av mitokondrie permeabilitet overgangen pore åpningen i isolerte mus hjerte mitokondrier er presentert her. Analysen involverer samtidig måling av mitokondrier Ca<sup> 2 +</sup> Håndtering, mitokondrie membran potensial og mitokondrie volum. Fremgangsmåten for å oppnå høy kvalitet og funksjonell hjerte mitokondriene er også beskrevet.
Abstract
Mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mtPTP) er en ikke spesifikk kanal som dannes i den indre mitokondrielle membranen å transportere oppløste stoffer med en molekylvekt mindre enn 1,5 kDa. Selv om definitive molekylære identiteten til pore er fortsatt under debatt, proteiner som cyclophilin D, VDAC og ANT bidra til mtPTP formasjon. Mens involvering av mtPTP åpning i celledød er godt etablert 1., samler bevis indikerer at mtPTP serverer en fysiologisk rolle under mitokondrie Ca 2 + homeostasis 2, bioenergi og redoks signalering 3.
mtPTP åpning er utløst av matrix Ca 2 +, men sin aktivitet kan moduleres av flere andre faktorer som oxidative stress, adenin nukleotid utarming, høye konsentrasjoner av Pi, mitokondrie membran depolarisering eller frakobling, og langkjedede fettsyrer 4. In vitro mtPTP åpning kan være achieved ved å øke Ca 2 + konsentrasjon inne i mitokondriematrix gjennom eksogene tilsetninger av Ca 2 + (kalsium oppbevaring kapasitet). Når Ca 2 + nivåer innenfor mitokondrier når en viss terskel, åpnes mtPTP og legger til rette Ca 2 + utgivelse, spredning av proton drivkraften, membranpotensiale kollaps og en økning i mitokondriematrix volum (hevelse) som til slutt fører til brudd på ytre mitokondriemembranen og irreversibelt tap av organeller funksjon.
Her beskriver vi en fluorometrisk analyse som gjør det mulig for en omfattende karakterisering av mtPTP åpning i isolerte mus hjerte mitokondrier. Analysen involverer samtidig måling av 3 mitokondrie parametere som endres når mtPTP åpning oppstår: mitokondrie Ca 2 + håndtering (opptak og utslipp, målt ved Ca 2 + konsentrasjon i analysemedium), mitokondriell membranpotensiale og mitochondrial volum. Fargestoffene anvendt for Ca 2 + måling i analysemedium og mitokondrielle membranpotensiale er Fura FF, en membran impermeant, Proporsjonal indikator som gjennomgår en endring i eksitasjonsbølgelengde i nærvær av Ca 2 +, og JC-1, en kationisk, Proporsjonal indikator som danner grønne monomerer eller røde aggregater ved lav og høy membranpotensiale, henholdsvis. Endringer i mitokondrie volum måles ved å registrere lysspredning ved mitokondrie suspensjonen. Siden høy kvalitet, funksjonelle mitokondrier er nødvendig for mtPTP åpningen analysen, har vi også beskrive de nødvendige skritt for å få intakt, svært kombinert og funksjonelle isolert hjerte mitokondrier.
Protocol
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver de nødvendige eksperimentelle skritt for å vurdere permeabilitet overgang pore åpningen i isolerte hjerte mitokondrier (Figur 1 og Figur 4): prosedyren for å isolere mus hjerte mitokondriene, respiratoriske kontroll som sikrer deres integritet og funksjonalitet, mitokondrie parametre overvåkes under mtPTP åpning og fargestoffer som benyttes for måling deres, opprettelsen av den spectrofluorometric instrumentering, og karakterisering av mt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
