Produktion, rening och cell invasion av intracellulära, cytoplasmiska fulla protein längd DISC1 aggresomes från cellkulturer och en märkt, multimert rekombinant DISC1 proteinfragment i<em> E. E. coli</em> Beskrivs. Cell invasivitet visas för mottagande celler i cellodling och för neuroner<em> In vivo</em> Efter stereotactical hjärna ympning.
Proteinaggregation ses som en allmän kännetecken av kroniska, degenerativa hjärnan tillstånd som, till exempel, i de neurodegenerativa sjukdomar Alzheimers sjukdom (Ap, tau), Parkinsons sjukdom (α-synuklein), Huntingtons sjukdom (polyglutamine, huntingtin), och andra. Proteinaggregering tros uppstå på grund av störd proteostasis, dvs obalansen mellan uppkomsten och nedbrytning av felveckade proteiner. Av notera är samma proteiner hittades aggregeras i sporadiska former av dessa sjukdomar som är mutant i sällsynta varianter av familjär former.
Schizofreni är en kronisk progressiv hjärna tillstånd som i många fall går längs med en permanent och oåterkallelig kognitiva underskott. I en kandidat gen metod undersökte vi om Störd-i-schizofreni 1 (DISC1), en gen klonad i en skotsk familj med koppling till kronisk psykisk sjukdom 1, 2, kunde hittas som olösliga aggregat i brain sporadiska fall av schizofreni 3. Med hjälp av SMRI CC identifierade vi i ungefär 20% av fallen med CMD men inte normala kontroller eller patienter med neurodegenerativa sjukdomar sarkosyl olöslig DISC1 immunreaktivitet efter biokemisk fraktionering. Senare studier in vitro visade att sammanläggning benägenhet DISC1 påverkades av sjukdomsassocierad polymorfism S704C 4 och att DISC1 aggresomes genereras in vitro var cell-invasiv 5, liknande vad som visats för Ap 6, 7-9 tau, α -synuklein 10, 11 polyglutamine, eller SOD1 aggregat 12. Dessa fynd fick oss att föreslå att åtminstone en delmängd av fall med CMD kan de med aggregerad DISC1 vara protein konformationella störningar.
Här beskriver vi hur vi skapar DISC1 aggresomes i däggdjursceller, rena dem på en sackarosgradient och använda dem för cell-invasivt studies. Likaså beskriver vi hur vi skapar ett exklusivt multimera C-terminala DISC1 fragment, etikett och rena det för studier cell invasivitet. Använda rekombinanta multimerer av DISC1 vi uppnå samma cell invasivitet som för en liknande märkt syntetisk α-synuklein fragmentet. Vi visar också att detta fragment tas upp in vivo när stereotaktiskt injiceras i hjärnan hos mottagande djur.
I denna studie beskriver vi rening av mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes från en transfekterad neuroblastomcellinje, förberedelse och märkning av ett rekombinant DISC1 protein arter och deras tillämpning i cell-invasionen experiment mottagande celler in vitro och in vivo.
Reningen av nativa mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes utvecklades från protokoll för att isolera Lewy body-liknande strukturer och större aggregat 13, 14, men modifierad för att undvika användning av detergenter och för att minimera risken för falska positiva cell-invasion som kan uppstå på grund av tvättmedel-underlättad membran penetration.
En möjlig framtida förbättringar kan vara i att ytterligare öka renheten hos de aggresomes genom sonikering att helt separata kvarvarande membran och cytoskeleton från aggresomes. Genom att öka totala renhet, det totala antalet invasion händelser som registrerats för stora aggresomes may ökas 5. Huruvida den begränsade definitionen av vårt förslag 3-fas sackaros är tillräcklig för aggresomes av andra proteiner arter måste testas, i denna mening det protokoll som beskrivs här ska ses som en utgångspunkt för individuell optimering. De renade aggresomes visade sig vara ganska robusta i våra händer, ytterligare steg tvätt (utan rengöringsmedel) för att eliminera spår av sackaros inte signifikant minska den totala avkastningen.
I en tidigare publikation beskrev vi att oligomer montering av DISC1 är beroende distinkta multimerisering domäner i C-terminalen 4 (Figur 4). Vi valde detta fragment för rekombinant löslig uttryckning i E. coli och efterföljande och Ni-NTA-rening. Att övervaka multimerisering och jämföra sin cell invasivitet med beskrivna cell-invasiv protein som α-synuklein, märkt vi DISC1 (598-785) med fluorescerande färgämne DyLight594, och jämfört sincell-invasivitet med den av lika märkt α-synuklein. Cell-invasivitet av den rekombinanta DISC1 fragmentet dramatiskt jämfört med den hos nativ, fullängds DISC1 aggresomes, sannolikt på grund av dess mindre storlek och mycket högre renhet. Återigen verkar renhet att spela en avgörande roll i cell-invasivitet.
I vårt exempel de invasiva aggresomes rekryterade lösligt homolog protein av mål-cellinjen som rekombinant uttrycktes i en löslig, dvs cell-dispergerad form. Uttryckningen av ett fluorescerande protein (t.ex. GFP eller RFP) i den mottagande cellinjen är en fördel eftersom den möjliggör samlokalisering av invasiva aggresomes och rekombinanta proteiner inom den mottagande cellen gränsen via Z-stack avbildning.
Cell-invasiva DISC1 aggresomes och multimera fragment uttrycks och renas från E. E. coli kan vara ett utmärkande drag av ett protein konformationssjukdomar sjukdomar relaterade till DISC1, DISC1opathies 15.
Felsökning:
Låg aggresome utbyte efter sackarosgradient rening:
Den sackarosgradient införas i detta protokoll fungerar bra med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående av andra proteiner kan vara av varierande dimensioner därför sackaros koncentrationerna bör optimeras av andra användare.
Otillräcklig rening av rekombinant protein:
Eventuella bakteriella föroreningar i reningsprocessen av det rekombinanta proteinet kommer också att märkas i senare steg i protokollet. För att undvika kontaminering, köra proteinet på en SDS-PAGE och bekräfta att det rekombinanta proteinet är åtminstone 95% ren genom färgning med Coomassie-blått. För att säkerställa högsta kvalitet och avkastning har protokollet optimeras för varje enskild protein.
Låg märkning efningsgrad av rekombinanta proteiner:
Eventuella föroreningar som innehåller fria SH-grupper kommer att minska effektiv märkning av proteinet. Därför är omfattande dialys och Ni-NTA baserad rening obligatorisk.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av neuron-Eranet upptäcka (BMBF 01EW1003) till CK och JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) till CKVB stöds av ett bidrag på Forschungskommission för Medicinska fakulteten vid universitetet i Düsseldorf.
Reagent name | Company | Catalog number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|