Den generation, oprensning og celleinvasion af intracellulære, cytoplasmatiske fuld længde DISC1 protein aggresomes fra cellekulturer og af en mærket, multimert rekombinant DISC1 proteinfragment i<em> E. coli</em> Beskrives. Cell invasionsevne er vist for recipientceller i cellekultur og for neuroner<em> In vivo</em> Efter stereotactical hjerne podning.
Proteinaggregering ses som en generelt kendetegn for kroniske, degenerative hjernesygdomme såsom for eksempel i neurodegenerative sygdomme Alzheimers sygdom (Ap, tau), Parkinsons sygdom (α-synuclein), Huntingtons sygdom (polyglutamine, huntingtin), og andre. Proteinaggregering menes at opstå på grund af forstyrret proteostasis, dvs ubalancen mellem opstår og nedbrydning af fejlfoldede proteiner. Det skal bemærkes, er de samme proteiner fundet sammen i de sporadiske former af disse sygdomme, som er mutant i sjældne varianter af familiær former.
Skizofreni er en kronisk fremadskridende hjernesygdom betingelse, at i mange tilfælde går sammen med en permanent og irreversibel kognitive underskud. I et kandidatgen fremgangsmåde, undersøgt om Forstyrret in skizofreni 1 (DISC1), et gen klonet i en skotsk familie med binding til kronisk mental sygdom 1, 2, kunne findes som uopløselige aggregater i brain af sporadiske tilfælde af skizofreni 3. Ved hjælp af SMRI CC, vi identificerede i cirka 20% af tilfældene med CMD men ikke normale kontroller eller patienter med neurodegenerative sygdomme sarkosyl-uopløselig DISC1 immunoreaktivitet efter biokemisk fraktionering. Efterfølgende undersøgelser in vitro viste, at aggregering tilbøjelighed DISC1 er påvirket af sygdom-associeret polymorfi S704C 4, og at DISC1 aggresomes genereret in vitro var celle-invasiv 5, ligner det, der var vist for Ap 6, tau 7-9, α -synuclein 10, polyglutamine 11 eller SOD1 aggregater 12. Disse resultater fik os til at foreslå, at i det mindste en delmængde af tilfælde med CMD, kan dem med aggregeret DISC1 være protein konformationelle lidelser.
Her beskriver vi, hvordan vi genererer DISC1 aggresomes i mammale celler, rense dem på en sucrosegradient og bruge dem til celle-invasionsevne Studies. Ligeledes beskriver vi, hvordan vi genererer en udelukkende multimere C-terminal DISC1 fragment, etiket og rense det for celle invasionsevne undersøgelser. Anvendelse af de rekombinante multimerer af DISC1 vi opnå samme celle invasivitet som for et tilsvarende mærket syntetisk α-synuclein fragment. Vi viser også, at dette fragment optages in vivo, når stereotaktisk injiceret i hjernen hos recipientdyr.
I denne undersøgelse beskrives oprensningen af mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fra en transficeret neuroblastom-cellelinje, fremstilling og mærkning af et rekombinant DISC1 proteinart og deres anvendelse i celle-invasion eksperimenter recipientceller in vitro og in vivo.
Oprensningen af native mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes blev udviklet fra protokoller til isolering af Lewy legeme-lignende strukturer og større aggregater 13, 14, men modificeret til at undgå brugen af detergenter og at minimere risikoen for falsk positive celle-invasion, som kan forekomme på grund af detergent-faciliteret membrangennemtrængning.
En mulig fremtidig forbedring kan være i yderligere at øge renheden af de aggresomes ved sonikering til helt adskilte tilbageværende membraner og cytoskeleton fra aggresomes. Ved at øge de samlede renhed, det samlede antal invasion begivenheder, der registreres for store aggresomes may forhøjes 5. , Om den begrænsede definition af vores foreslåede 3-fase sucrose er tilstrækkelig til aggresomes af andet protein arter skal testes, i den forstand protokollen beskrevet her, bør betragtes som et udgangspunkt for individuel optimering. De oprensede aggresomes sig at være ganske robust i vores hænder, yderligere vasketrin (uden detergent) for at fjerne spor af saccharose ikke signifikant reducere det samlede udbytte.
I en tidligere publikation beskrev vi, at oligomer samling af DISC1 er afhængig af forskellige multimerisering domæner i den C-terminale ende 4 (figur 4). Vi valgte dette fragment for rekombinant opløselig ekspression i E. coli og efterfølgende og Ni-NTA-oprensning. For at overvåge sin multimerisering og sammenligne sin celle invasiv med en beskrevet celle-invasiv protein som α-synuclein, vi mærkede DISC1 (598-785) med det fluorescerende farvestof DyLight594, og sammenlignet sincelle-invasionsevne med den for lige mærket α-synuclein. Den celle-invasionsevne af det rekombinante DISC1 fragmentet blev dramatisk forøget sammenlignet med den for nativ, fuld længde DISC1 aggresomes, sandsynligvis på grund af deres mindre størrelse og større renhed. Igen, renhed synes at spille en afgørende rolle i celle-invasionsevne.
I vores eksempel de invasive aggresomes rekrutteret opløseligt homolog protein ifølge målcellelinie, der udtrykkes rekombinant i en opløselig, dvs celle-dispergeret form. Ekspressionen af et fluorescerende protein (f.eks GFP eller RFP) i modtagerens cellelinie er en fordel, eftersom den muliggør colokalisering af invasive aggresomes og rekombinante proteiner i recipientcellen grænse via Z-stack billeddannelse.
Celle-invasive DISC1 aggresomes og multimere fragmenter udtrykt og oprenset fra E. coli kunne være et definerende træk ved et protein konformationelle sygdomme i forbindelse med DISC1, DISC1opathies 15.
Trouble shooting:
Lavt aggresome udbytte efter saccharosegradient oprensning:
Saccharosegradienten introduceres i denne protokol fungerer godt med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående af andre proteiner kan være af variable dimensioner derfor saccharose-koncentrationer bør optimeres af andre brugere.
Utilstrækkelig oprensning af rekombinant protein:
Eventuelle bakterielle forurenende stoffer i oprensningsprocessen for det rekombinante protein vil også mærkes i senere trin i protokollen. For at undgå kontaminering, køres proteinet på en SDS-PAGE og bekræfter, at det rekombinante protein er mindst 95% rent ved farvning med Coomassie-blå. At sikre den højeste kvalitet og udbytte, protokollen skal optimeres for hvert enkelt protein.
Lav mærkning eftet af rekombinante proteiner:
Eventuelle forureninger, der indeholder frie SH-grupper vil falde effektiv mærkning af proteinet. Derfor omfattende dialyse og Ni-NTA-baseret oprensning er obligatorisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NEURON-Eranet opdage (BMBF 01EW1003) til CK og JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CKVB understøttes af en tildeling af Forschungskommission af det medicinske fakultet ved universitetet i Düsseldorf.
Reagent name | Company | Catalog number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|