侵入细胞DISC1蛋白种类的产生，纯化及表征

Summary

的产生，纯化和细胞浸润的细胞，胞浆全长DISC1蛋白aggresomes从细胞培养和标记，多聚重组DISC1蛋白片段中

Abstract

蛋白质聚集的被看到作为一个一般标志的慢性，退行性脑条件类似，例如，在神经退行性疾病中阿尔茨海默氏病（Aβ，tau蛋白），帕金森氏病（α-突触核蛋白），亨廷顿氏疾病（多聚谷氨酰胺，亨廷顿），和其他。蛋白质聚集被认为是发生不安proteostasis， 即错误折叠的蛋白质的产生和降解之间的不平衡。值得注意的是，同样的蛋白质被发现聚集在散发性疾病是罕见的变异的突变体在家族形式。

精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病，在许多情况下，伴随着一个永久性的，不可逆的认知功能障碍。在候选基因的方法，我们调查是否破坏精神分裂症1（DISC1），一个基因在苏格兰的家庭与联动，慢性精神疾病^1，2，可以发现，作为不溶性聚集在腹腔n的³精神分裂症的散发病例。使用SMRI CC，我们发现在约20％的病例与CMD，但不正常的控制或与神经退行性疾病的患者的肌氨酸不溶于DISC1免疫生化分离后。随后的研究表明， 在体外的聚集倾向的DISC1疾病相关的基因多态性S704C ^4的影响，并且在体外产生DISC1 aggresomes细胞侵入性的^5，类似于已^Aβ6所示，tau蛋白^7-9，α -突触核蛋白^11，10，多聚谷氨酰胺或SOD1的聚集体^12。这些发现提示我们建议用CMD的至少一个子集的情况下，那些凝集DISC1可能会对蛋白质构象疾病。

在这里，我们将介绍如何在哺乳动物细胞中产生DISC1 aggresomes，净化他们的蔗糖梯度，并使用它们细胞侵袭STUDI的ES。同样，我们将介绍如何生成一个专门的多聚C-端DISC1片段，标签和净化细胞侵袭的研究。使用重组的多DISC1我们实现类似的细胞侵袭类似的标记合成的α-突触核蛋白片段。我们还表明，该片段在体内时，立体定位注射到受体动物的大脑。

Protocol

1。聚集小体细胞转染制备的单体红色荧光蛋白（MRFP）或增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的人类全长（FL）DISC1

1. 种子1.5×10 ^6/10厘米的菜人类神经母细胞瘤民族解放阵线（NLF费城儿童医院，费城，PA）在10 10 cm培养皿中的细胞和生长过夜。 NLF培养细胞在RPMI-1640培养基中补充有10％FBS，青霉素/ L-谷氨酰胺Strepomycin。第二天，细胞应在70％至80％汇合。
2. 瞬时转染每个10 cm培养皿中，用15微克质粒DNA和Metafectene的转染试剂（Biontex，Martinsried，德国）。简言之，为10 cm培养皿中，加入15微克质粒DNA和30μlMetafectene转染到750微升的Opti-MEM，混合，并在室温孵育20分钟。 5菜肴，与pcDNA3.1 MRFP /绿色荧光蛋白标记的人（FL）的DISC1和5菜的绿色荧光蛋白的质粒单独转染。

2。聚集小从转染供体细胞的分离纯化

这里所描述的协议是从脑组织¹³和协议来隔离大团聚体和aggresomes ^14的一个方法来净化路易机构的组合。由于现有的方法是基于使用的洗涤剂，洗涤剂 - 自由蛋白细胞入侵性的测定中的应用程序的隔离是至关重要的。

1. 转染后48小时，监测表达eGFP和mRFP/eGFP-DISC1，在荧光显微镜下（ 图1），确认形成aggresomes。
2. 刮pH为7.4，用400μl的PBS中每个用PBS液洗涤细胞，添加1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche公司，印第安纳波利斯，IN）和使用一个Precellys24均化器（贝尔坦技术，法国）破坏细胞。简单地说，加1 ml细胞悬浮液2毫升的裂解管，并添加10个陶瓷珠。裂解细胞，用3×60秒的脉冲。的过程中的机械力可能增加样本内的温度超过37°C，因此冰后的裂解过程中，应采取放松的样品。
3. 细胞在冰上冷却，加10毫米的MgCl _2，40 U / ml的DNA酶A和孵育60分钟，在37°C
4. 准备解决方案，为80％，50％，20％的蔗糖（重量/体积），在PBS pH为7.4（10毫升）。
5. 准备15毫升falcon试管中开始，用2毫升80％的蔗糖，其次是50％和20％的蔗糖梯度。慢慢倒入梯度，要小心，不要去打扰已经浇层。层之上的梯度和离心机消化的溶胞产物在4℃下15分钟，在1000×g离心
6. 仔细收集相间50-80％蔗糖层之间，用移液管和混合用5倍体积的PBS pH值7.4。在4℃下离心15分钟，在1000×g离心重复洗2次。在此相间，aggresomes的荧光，在显微镜下可以可视化的UV光。
7. 弃去上清并悬浮颗粒在250-500微升PBS pH值7.4。该颗粒包含的：纯化aggresomes（ 图2）。

3。收件人的SH-SY5Y细胞治疗mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

1. 种子5×10 ^4个收件人的SH-SY5Y人成神经细胞瘤细 ​​胞组成型表达的GFP-DISC1（598-854），在24孔板的各孔中的无菌玻璃盖玻片上。 SH-SY5Y细胞培养在DMEM/F-12培养基与青霉素/链霉素，非必需氨基酸（NEAA）和10％FBS。
2. 24小时后，每孔加入10μl，孵育48-72小时。
3. 洗涤细胞3×，pH为7.4的PBS和急冷5分钟，用0.​​04％的台盼蓝的细胞外荧光。
4. 在冰上10分钟，在PBS pH值7.4用4％PFA固定细胞，用无菌H _{2 O}洗一次并挂载在载玻片上的盖玻片的ProLong用DAPI安装培养基（Invitrogen公司，美国）的黄金。
5. 确认的吸收/入侵外源性应用aggresomes的共存与招募栈Z-图像所表达的受体细胞的蛋白质。

然而，外源蛋白的吸收/入侵可能没有本质的招聘宿主细胞蛋白的同时检测。在我们的例子中MRFP标签DISC1 aggresomes招可溶性GFP标记DISC1（598-854）由宿主细胞表达的蛋白质（参见图3）。图片采取了蔡司LSM 510共聚焦或一个蔡司Axiovision Apotome2显微镜。

4。产生的重组DISC1（598-785）

在以前的出版物中，我们分析自基于自缔合结构域的存在下相互作用的能力的各种DISC1蛋白片段。其中所有的蛋白质片段测试人类DISC1（598-785）显示最强的多聚倾向^4（ 图4）。因此，人类DISC1（598-785）被克隆到pET15b（否沃根，麦迪逊，威斯康星州）的N-末端含有6 -组氨酸标记，在大肠杆菌中表达大肠杆菌 BL21（lDE3）罗塞塔（Novagen公司，美国），在变性条件下在8摩尔/升尿素所描述⁴纯化。总之，该协议被概述如下。

1. BL21（IDE3）罗塞塔E.大肠杆菌生长在含有5mM的-精氨酸盐酸，5mM的MgSO 4干燥，100微克/毫升carbencillin，35微克/毫升氯霉素的OD _600的 2×500毫升2YT：0.6-0.8和DISC1（598-785）表达诱导用1mM IPTG。
2. DISC1（598-785）表达在37℃下4小时，通过离心收获细菌表达终止。
3. 将细菌沉淀悬浮于50ml TE缓冲液（50mM的pH为8.0的Tris-HCl，5mM EDTA）中加2mM的PMSF，1％TX-100，250微克/毫升溶菌酶的20mM MgCl ₂和400 U/50毫升DNA酶一若要确保完全裂解，反应在室温缓慢搅拌下温育30分钟。
4. 添加10毫米β-mercapt“oethanol（ME）和500 mM NaCl和另一个30分钟的孵育。
5. 自旋向下的细菌包涵体20.000克30分钟，在4°C。
6. 重悬沉淀在50ml提取缓冲液中含有50mM的Tris pH值8.0，5mM咪唑，500mM NaCl的，​​8M尿素和10mM的β-ME和删除在20.000克碎片通过离心30分钟，在4℃下
7. 用提取缓冲液，洗净的Ni-NTA琼脂糖矩阵。孵育再悬浮，precleared的的蛋白质提取物用Ni-NTA基质2小时，在RT。
8. 用提取缓冲液含有12 mM咪唑的Ni-NTA基质洗净。
9. 用15毫升的洗脱缓冲液含有300mM咪唑的50mM Tris，500mM NaCl的，​​8M尿素，1mM的PMSF，5mM EDTA和10mM的β-ME，慢慢洗脱蛋白质。
10. 透析蛋白逐步PBS pH7.4的含10mMβ-ME。

从1 L细菌开始培养它可以分离高达50毫克重组DISC1（598-785）PROTEIN。

α-突触核蛋白复性

对于实验与α-突触核蛋白，500微克的重组蛋白（Sigma-Aldrich公司，美国）溶解在PBS中的浓度为1毫克/毫升。为了获得低聚物，重折叠进行过夜，在37℃下，如先前的出版物¹⁰中所述。

5。标签重组DISC1（598-785）DyLight594的

1. 之前在随后的贴标过程中，DISC1（598-785）蛋白在被释放β-ME的。因此，该蛋白质是透析3次，PBS pH7.4的1:2,000稀释。
2. 标签DISC1 1毫克（598-785）马来酰亚胺（DyLight 594的Thermo Scientific，USA）根据制造商的说明。总之，1毫克/毫升的蛋白质在P​​BS pH7.4的溶解，和添加5mM的TCEP复原游离的巯基。加入20μl的DMF中溶解的染料的反应，并在室温孵育2小时。
3. 透析蛋白3×PBS pH值7.4在1:2000的比例为2小时，每个。

为了进一步增加标记的蛋白质的纯度的His ₆标签的基础上的Ni-NTA柱进行亲和纯化。

4. 洗净1毫升Ni-NTA的基质（Qiagen，德国）用10ml PBS pH为7.4。
5. 标记，透析蛋白的列，让它慢慢运行在列。
6. 洗净，用3×20毫升PBS的pH为7.4的蛋白质
7. 同时监测的着色的频带上的Ni-NTA柱减少的洗脱液体积，pH为7.4，500mM咪唑滴加用PBS洗脱该蛋白质。
8. 透析的洗脱液3×10mM的NAPI pH为​​7.4的稀释度1:2000每次2小时。
9. 使用无菌的0.45μm的注射器过滤器进行过滤的洗脱液，在5×100微升样品在液氮中急速冷冻的等分试样。蛋白质的总量应为0.5 - 1微克/毫升在每100μl等分。

可选的concentrATION步骤

10. 对于大鼠注射stereotactical，蛋白质浓缩10倍速度真空（Eppendorf公司选矿厂5301）。最后的缓冲条件为100毫米NAPI。

α-突触核蛋白的标签

的标记和纯化的重组α-突触核蛋白（Ni-NTA柱）是并行执行的DISC1（598-785）。总的起始原料为500微克，而不是1毫克DISC1（598-785）。

6。收件人的SH-SY5Y细胞的标记重组DISC1（598-785）蛋白的治疗

1. 种子5×10 ⁴收件人的SH-SY5Y人成神经细胞瘤细 ​​胞组成型表达的GFP-DISC1（598-854），在24孔板的各孔中的无菌玻璃盖玻片上。
2. 添加标记的蛋白质为5-10微克/毫升的浓度在细胞培养基中孵育48-72小时。
3. 洗涤细胞3×，pH为7.4的PBS和淬火提取用0.04％的台盼蓝5分钟ellular荧光。
4. 在冰上10分钟，在PBS pH值7.4用4％PFA固定细胞，用无菌H _{2 O}洗一次并挂载在载玻片上的盖玻片的ProLong用DAPI安装培养基（Invitrogen公司，美国）的黄金。
5. 确认的摄取外源重组蛋白的共存与招募蛋白表达的受体细胞所产生的激光扫描共聚焦显微镜图像栈Z-/入侵。然而， - 招聘内源性蛋白质可能基本上不被检测到入侵宿主细胞蛋白质平行，Z堆叠图像仍可以确认的侵入性的蛋白质的性质。

在我们的例子中录制。 DISC1（598-785）*至少部分新兵可溶性GFP标记DISC1（598-854）由宿主细胞表达的蛋白质（参见图5A）。对于重组α-突触核蛋白入侵但没有招聘所示（ 图5B）。照片拍摄在蔡司LSM 510共聚焦一个蔡司Axiovision Apotome2显微镜。

该注射液的浓缩（约4微升2.5微克/微升），内侧前额叶皮质的查询结果在注射部位周围的蛋白质可被检测即使灌注后的动物传播到标记为DISC1（598-785）*在PBS pH7.4的4％PFA诺丹明filterset。 DISC1（598-785）的是，在我们的例子中采取了由不同的神经元数目，并可以监控与Z堆叠成像（ 图6）。

在一般情况下，注射其他的蛋白质这里所使用的那些不必然导致细胞的入侵。入侵事件本质上是依赖于该蛋白质的性质，但一个干净的净化是一个先决条件，作进一步的分析。

7。代表性的成果

从NLF细胞组成的重组FL DISC1-EGFP纯化Aggresomes入侵收件人SH-SY5Y CE的LLS效率低（约^{0.3％5），}如看到的用共聚焦显微镜（ 图3）的共定位。据此前报道，DISC1（598-785） 从 E的表达和纯化大肠杆菌形成多聚体⁴也同样侵入性细胞的效率为约^20％5（ 图5A）作为阳性对照（ 图5B），它被应用于平行类似的α-共核蛋白。从E.标记的重组DISC1（598-785）表达和纯化大肠杆菌细胞侵入神经 ​​元在体内的多聚蛋白立体定向注射到老鼠（ 图6 PUM，贝德，休斯顿，科思，未发表）内侧前额叶皮质的。

图1。NLF瞬时表达的神经母细胞瘤细 ​​胞：FP-DISC1（红色）。红色荧光aggresomes的可DETE反恐执行局在细胞内。

图2纯化的MRFP标签后DISC1 aggresomes，在蔗糖密度梯度纯化。

图。荧光图像的入侵aggresomes。 ，进行纯化，MRFP标签flDISC1 aggresomes和培养SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞过表达可溶性GFP-的标签DISC1（598-854）。吸收标记aggresomes的监测上的激光扫描显微镜（蔡司LSM 510）Z-叠加成像。

图4。SEC高调的建议。 DISC1（598-785）含有S704和C704的单核苷酸多态性（SNP）。两个变种中断，有序的寡聚化和形成的超高分子量多个imers（红色箭头）。此图像被修改从出版物Leliveld 等人 2009年，生物化学。

图5。荧光Z堆栈的图片侵入性的DyLight的标记重组DISC1（598-785）。 SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞表达可溶性的GFP-DISC1（598-854）的孵育与标记的重组蛋白在5微克/毫升的浓度。 （A）红聚集入侵的建议，。 DISC1蛋白（598-785）和黄点表示聚集的招聘可溶性GFP-DISC1（598-854）。 （B）重组α-突触核蛋白（红色）侵入细胞没有招聘的频率在20％左右。 点击此处查看大图 。

图6。免疫荧光图片注入的标记，重组DISC1（598-785）蛋白。 Z堆叠成像确认记录的存在下。 DISC1蛋白（598-785）的大鼠皮层神经元与神经元的的核（NEUN，绿色）的抗体染色。

Discussion

在这项研究中，我们描述的净化起的mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes转染神经母细胞瘤细 ​​胞系，准备和标签的重组DISC1蛋白种类和他们的应用程序在入侵细胞的受体细胞在体外和体内实验。

从协议开发的纯化的固有mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes隔离Lewy体样的结构和较大的聚集体^13，14，但修改，以避免使用洗涤剂，以尽量减少可能发生的假阳性细胞入侵的风险由于洗涤剂促进的膜渗透。

一个可能的未来的改善可能是在进一步提高纯度的aggresomes通过超声完全分开，其余的细胞膜和细胞骨架的aggresomes。通过提高整体纯度总的入侵事件，，马大aggresomes记录可以增加^5。有限的定义，我们建议的3相蔗糖是否是足够aggresomes其他蛋白物种，以进行测试，在这个意义上的协议这里列出应被视为单个优化的一个起点。的的纯化aggresomes被证明是相当强大的，在我们的手中，不用洗衣粉的洗涤步骤（），以消除痕迹蔗糖的整体收益率并没有显着减少。

在以前的出版物中，我们描述了低聚物的DISC1组装是依赖于不同的多聚化域的C-末端^4（ 图4）中。我们选择了这个片段在大肠杆菌中的可溶性表达的重组大肠杆菌和随后的Ni-NTA净化。为了监视它的多聚化，并比较其与所述的细胞侵入性的蛋白，如α-突触核蛋白细胞的侵袭性，我们标记DISC1（598-785）与荧光染料DyLight594中，和比较其同样标记的α-突触核蛋白细胞的侵袭。重组DISC1片段细胞侵袭力急剧增加相比，本地的，全长DISC1 aggresomes，可能是由于其更小的尺寸和更高的纯度。同样，的纯度似乎发挥了决定性的作用，在细胞侵袭。

在我们的例子中的侵入aggresomes招募可溶性同源蛋白的重组表达的靶细胞线在一种可溶性的， 即细胞分散的形式。一种荧光蛋白（ 如 GFP或RFP）中的表达，在受体细胞线是一个优点，因为它允许通过Z堆叠成像侵入aggresomes和重组蛋白的共定位在受体细胞的限制之内。

从大肠杆菌表达和纯化的细胞侵入性的DISC1 aggresomes和多聚体片段大肠杆菌可能是一个定义功能的蛋白质构象病有关DISC1，DISC1opathies ^15。

故障排除：

聚集小产量低蔗糖密度梯度纯化后：

在该协议中的蔗糖密度梯度介绍以及与eGFP/mRFP-DISC1（FL）aggresomes的。其他蛋白质组成的aggresomes可能会对因此可变尺寸应该优化的蔗糖浓度，由其他用户。

纯化的重组蛋白不足：

也将被标记的重组蛋白在纯化过程中的任何细菌污染物在后面的步骤的协议。为了避免污染，蛋白的SDS-PAGE上运行，并确认该重组蛋白是至少95％纯的，通过用考马斯亮蓝染色。为了保证最高的质量和产量，为每个蛋白质的协议进行优化。

低标签效应FICIENCY的重组蛋白：

包含游离SH基团的任何污染，会降低有效标记的蛋白质。因此，广泛的透析和Ni-NTA柱纯化​​是强制性的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093	Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12	Invitrogen	11320-033	Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS	Invitrogen	14190-250
Metafectene	Biontex	T020-1.0	Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210	The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I	Roche	04716728001	There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062	Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122	Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA)	Sigma-Aldrich	M7145	Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154	Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide	Thermo-Fisher Scientific	46608	Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI	Invitrogen	P36935	This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein	Sigma	S7820	Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24	Bertin Technologies	03119.200.RD000	We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac)	Eppendorf	5301 000.210	Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2	Zeiss	See manufacturers catalog	Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material	Nunc	10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475	The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments 1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG. 2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer. 3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME 4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added. 5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on. 6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4 7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP Table of recipes.