Produksjon, rensing og celle invasjon av intracellulære, cytoplasmatiske full lengde Disc1 protein aggresomes fra cellekulturer og en merket, multimeric rekombinant DISC1 protein fragment i<em> E. coli</em> Er beskrevet. Cell invasivitet vises for mottakerland celler i cellekultur og for neuroner<em> In vivo</em> Etter stereotactical hjernen inokulering.
Proteinaggregering ses som en generell kjennetegn av kroniske, degenerative hjernen forhold som for eksempel i de neurodegenerative sykdommer Alzheimers sykdom (Aβ, tau), Parkinsons sykdom (α-synuclein), Huntingtons sykdom (polyglutamine, huntingtin), og andre. Proteinaggregering antas å oppstå på grunn av forstyrret proteostasis, dvs. ubalanse mellom oppstår og nedbrytning av misfolded proteiner. Av notatet, er de samme proteinene funnet aggregert i sporadiske former av disse sykdommene som er mutant i sjeldne varianter av familiære former.
Schizofreni er en kronisk progressiv hjernen tilstand som i mange tilfeller går sammen med en permanent og irreversibel kognitiv underskudd. I en kandidat genet tilnærming, undersøkte vi hvorvidt Forstyrret-in-schizofreni 1 (DISC1), et gen klonet i en skotsk familie med ledd til kronisk mental sykdom 1, 2, kan bli funnet som uoppløselige aggregater i Brain av sporadiske tilfeller av schizofreni 3. Bruke SMRI CC, identifiserte vi i ca 20% av tilfellene med CMD, men ikke normale kontrollpersoner eller pasienter med nevrodegenerative sykdommer sarkosyl-uløselig DISC1 immunoreaktivitet etter biokjemisk fraksjonering. Senere studier in vitro viste at aggregering tilbøyelighet DISC1 ble påvirket av sykdomsassosierte polymorfisme S704C 4, og at Disc1 aggresomes generert in vitro var celle-invasiv 5, i likhet med hva hadde blitt vist for Aβ 6, 7-9 tau, α 10-synuclein, 11 polyglutamine eller SOD1 aggregater 12. Disse funnene bedt oss om å foreslå at minst en undergruppe av tilfellene med CMD, kan de med aggregert DISC1 være protein konformasjonsforandringer lidelser.
Her beskriver vi hvordan vi genererer Disc1 aggresomes i pattedyrceller, rense dem på en sukrosegradient og bruke dem for celle-invasivitet studies. Tilsvarende beskriver vi hvordan vi genererer en utelukkende multimeric C-terminal DISC1 fragment, etikett og rense det for celle invasivitet studier. Bruke rekombinante multimerer av DISC1 oppnår vi lignende celle invasivitet som for en tilsvarende merket syntetisk α-synuclein fragment. Vi viser også at dette fragment blir tatt opp i vivo når stereotactically injisert i hjernen mottakerland dyr.
I denne studien vil vi beskrive rensing av mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fra en transfekterte neuroblastom celle linje, forberedelse og merking av et rekombinant Disc1 protein arter og deres anvendelse i celle-invasjon eksperimenter mottakerlandenes celler in vitro og in vivo.
Rensing av native mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes ble utviklet fra protokoller å isolere Lewy body-lignende strukturer og større aggregater 13, 14, men modifisert for å unngå bruk av vaskemidler og for å minimere risikoen for falske positive celle-invasjon som kan oppstå på grunn av vaskemiddel-tilrettelagt membran penetrasjon.
En mulig fremtidig forbedring kan være i å ytterligere øke renheten av aggresomes etter sonikering til helt separate gjenværende membraner og cytoskjelettet fra aggresomes. Ved å øke samlet renhet, antall totale invasjon hendelser som registreres for store aggresomes may økes 5. Hvorvidt den begrensede definisjonen av vårt forslag 3-faset sukrose er tilstrekkelig for aggresomes av andre protein arter må prøves, i denne forstand protokollen beskrevet her skal betraktes som et utgangspunkt for individuell optimalisering. Den rensede aggresomes viste seg å være ganske robust i våre hender, ekstra vask trinn (uten vaskemiddel) for å eliminere spor av sukrose ikke signifikant reduserer den totale avkastningen.
I en tidligere publikasjon beskrev vi at oligomer montering av DISC1 avhenger distinkte multimerization domener i C-terminus 4 (figur 4). Vi valgte denne fragment for rekombinant løselig uttrykk i E. coli og påfølgende og Ni-NTA rensing. Å overvåke multimerization og sammenligne sin celle invasivitet med en beskrevet celle-invasiv protein som α-synuclein, merket vi DISC1 (598-785) med fluorescerende fargestoff DyLight594, og sammenlignet sincelle-invasivitet med at av like merket α-synuclein. Cellen-invasivitet av rekombinante DISC1 fragmentet ble dramatisk økt sammenlignet med native, full lengde Disc1 aggresomes, sannsynligvis på grunn av sin mindre størrelse, og mye høyere renhet. Igjen synes renhet til å spille en avgjørende rolle i celle-invasivitet.
I vårt eksempel de invasive aggresomes rekruttert løselig homolog protein av målet cellelinje som ble rekombinant uttrykt i en løselig, dvs. celle-dispergert form. Uttrykk for en fluorescerende protein (f.eks GFP eller RFP) i mottakeren cellelinjen er en fordel siden den tillater colocalization av invasive aggresomes og rekombinante proteiner innenfor mottakercellen grensen via Z-stack bildebehandling.
Cell-invasive Disc1 aggresomes og multimeric fragmenter uttrykt og renset fra E. coli kan være et definerende trekk av et protein konformasjonsforandringer sykdommer knyttet til DISC1, DISC1opathies 15.
FEILSØKING:
Lav aggresome yield etter sukrosegradient rensing:
Den sukrosegradient introdusert i denne protokollen fungerer godt med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående av andre proteiner kan være av variable dimensjoner derfor sukrosen konsentrasjoner bør optimaliseres av andre brukere.
Utilstrekkelig rensing av rekombinant protein:
Eventuelle bakterielle forurensninger i renseprosessen av det rekombinante protein vil også merkes i senere trinn av protokollen. Å unngå forurensninger, kjøre protein på en SDS-PAGE og bekreft at det rekombinante protein er minst 95% rent ved farging med Coomassie-blå. For å sikre høy kvalitet og kapasitet, har protokollen for å være optimalisert for hver enkelt protein.
Lav merking efficiency av rekombinante proteiner:
Eventuelle forurensninger som inneholder frie SH-grupper vil redusere effektiv merking av proteinet. Derfor er omfattende dialyse og Ni-NTA basert rensing obligatorisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Neuron-Eranet oppdage (BMBF 01EW1003) til CK og JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CKVB er støttet av en bevilgning på Forschungskommission av Det medisinske fakultet ved Universitetet i Düsseldorf.
Reagent name | Company | Catalog number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|