Summary
גישה יעילה להכנת nanofibers מעוטר בקבוצות המסוגלים אינטראקציה ספציפית עם חלבונים תפקודיות מתוארת. הגישה דורשת 1 הכנת פולימרים פונקציונליים עם הקבוצה הפונקציונלית המתאימה. הפולימרים הפונקציונליים הם מפוברקים לnanofibers ידי electrospinning. היעילות של הכריכה של nanofibers עם חלבון ונלמדת על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
Electrospinning הוא שיטת עיבוד יעילה להכנת nanofibers מעוטר בקבוצות פונקציונליות. Nanofibers מעוטר בקבוצות פונקציונליות עשוי להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות חומר סמן ביולוגי כלומר מעשה כbiosensors עם פוטנציאל כמו גלאי מולקולה בודדות. פתחנו גישה יעילה להכנת פולימרים פונקציונליים שבו יש את היכולת הפונקציונלית של במיוחד מחייב עם מודל חלבון. במערכת המודל שלנו, הקבוצה הפונקציונלית היא 2,4-dinitrophenyl (DNP) והחלבון הוא אנטי DNP IgE (אימונוגלובולין E). הפולימרים פונקציונליים, α, ω דו [2,4-dinitrophenyl caproic] [פולי (אתילן אוקסיד)-B-פולי (2-methoxystyrene)-B-פולי (אתילן אוקסיד)] (-CDNP-PEO-P2MS-PEO CDNP), הוא הוכן על ידי החיים פילמור anionic. יוזם difunctional מנוצל בפילמור הוכן על ידי תגובת אלקטרון העברת α-methylstyrene ומתכת אשלגן (מראה). מונומר 2-methoxystyrene נוסףראשון שהיוזם, ואחריו על ידי התוספת של מונומר השני, אתילן אוקסיד, ולבסוף הפולימר החי הופסק על ידי מתנול. Α, ω-dihydroxyl פולימר [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] היה מגיב עם חומצת N-2 ,4-DNP-∈ אמין caproic, על ידי צימוד DCC, וכתוצאה מכך ההיווצרות של α, ω דו [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [פולי (ethyleneoxide)-B-פולי (2-methoxystyrene)-B-פולי (אתילן אוקסיד)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). הפולימרים התאפיינו FT-IR, NMR H 1 וג'ל חלחול כרומטוגרפיה (GPC). התפלגויות המשקל המולקולריות של הפולימרים היו צרות (1.1-1.2) ופולימרים בעלי משקל מולקולרי גדול מ 50,000 שמשו במחקר זה. הפולימרים היו צהובות ואבקות מסיסות בtetrahydrofuran. מסיסים במים CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (גליקול dimethoxyethylene) מורכבים נקשר ומשיגים מחייב מצב יציב עם הפתרון IgE בתוך כמה שניות. משקל מולקולרי גבוה יותר (כלומר מסיס מים כ -50,000) CDNפולימרי P-PEO-P2MS-PEO-CDNP, המכיל פחמן קיר אחד% 1 (SWCNT) עובדו לnanofibers האלקטרו (100 ננומטר ל 500 ננומטר קוטר) על מצע סיליקון. Fluorescence ספקטרוסקופיה מראה כי אנטי DNP IgE האינטראקציה עם nanofibers באמצעות קשירה עם הקבוצות הפונקציונליות DNP לקשט את הסיבים. תצפיות אלו מצביעות על כך שnanofibers כראוי פונקציונלי לקיים הבטחה לפיתוח מכשיר איתור סמן ביולוגי.
Protocol
1. סינתזה של α, ω-dihydroxyl פולימר [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- להרכיב כור פילמור כפי שמוצג באיור 1. הכור לצורך הניסוי הזה מורכב מתחתית בקבוק 100 מיליליטר סיבוב 2-צוואר שמשותף סטנדרטי להתחדד חיצוני (Chemglass), שני מתאמים לבקרת זרימה עם ברזים למיניהם (Chemglass), ואת מוט 1 טפלון ערבוב. מתאם (איור 1) שמש כדי לשמור על טוהר חנקן גבוה במיוחד (UHP) זורם דרך המערכת על מנת למנוע אוויר ולחות מלהיכנס למערכת אינרטי. המתאם B (איור 1) שמש כדי להזריק, מונומר הממס, ויוזם לתוך בקבוקון התגובה.
- ייבש 200 מ"ל של Tetrahydrofuran (THF) על מתכת Na, באמצעות benzophenone כמחוון, למינימום של 6 שעות בגז חנקן יבש.
- ייבוש 10 מ"ל של 2-methoxystyrene מעל הידריד הסידן ל24 שעות.
- הכן אמבטית טמפרטורה קרה נשמרת ב-78 ° C באמצעות תערובת נוזלית של isopropanolחנקן נוזלי nd.
- הוסף 25 מ"ל של THF לתוך בקבוקון תגובת פילמור (ראה תרשים 1) תחת גז חנקן ולשמור על כור בגז חנקן במשך כל פילמור.
- סיבוב בקבוק 100 מיליליטר מקום תחתון לslurry.
- הוסף 2 מ"ל (0.27 mmol / מ"ל) של פתרון היוזם לתוך בקבוקון התגובה.
- הזרק מונומר הראשון, 2-methoxystyrene (4 מ"ל) לתוך בקבוקון התגובה.
- אפשר להמשיך תגובה ל40 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מונומר השני, אתילן אוקסיד.
- אפשר להמשיך פילמור בטמפרטורת חדר במשך ימים.
- לסיים את הפולימר עם HCl (6 ז) / מתנול (1/20, כרך / כרך).
- לטהר את הפולימר ידי החיש לhexanes ופולימר יבש בתנור ואקום.
- לאפיין את הפולימר באמצעות NMR.
2. Functionalization של α, פולימר ω-dihydroxyl עם חומצת Caproic N-2 ,4-DNP-Ε אמין לקבל Polym הפונקציונליאה, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- בבקבוק צוואר שלושה, למקם את פולימר α, ω-dihydroxyl (0.05 mmol), חומצת caproic N-2 אמין ,4-DNP-E (0.25 mmol), DCC (0.15 mmol) וDMAP (0.005 mmol) ו להתייבש על קו ואקום במשך 4 שעות.
- לזקק dichloromethane היבש (10 מ"ל) לתוך הבקבוק.
- לשחרר את הוואקום תחת חנקן ומערבבי תגובה ל12 שעות בטמפרטורת חדר.
- תערובת מסנן תגובה ולהתאושש פולימר ידי החיש פעמים לhexanes ומתנול.
- יבש זרז פולימר בתנור ואקום ב 40 ° C.
- לקבוע את המבנה ופונקציונלי הפולימר ידי FT-IR וH 1 NMR.
3. הכנת פתרון CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT לelectrospinning
- ממס% 20 w של CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP בchlorobenzene.
- ממס% 20% 40 w וw של פוליסטירן (MW 800000) בchlorobenzene להכין שני פתרונות. פוליסטירן המולקולרי הגבוה יותר משמש לincreasדואר הסתבכות פולימר שרשרת שרשרת ולהשיג את הצמיגות האופטימלית הנדרשת לelectrospinning.
- מערבב את פתרוני הפולימר שהוכנו ב3.1 ו -3.2 יחד כדי ליצור 1:1 ו01:02 יחסים של הפולימרים ולהוסיף 1% w צינורות יחידי קירות פחם (SWCNT) לתערובת ומערבבים ללילה אפילו חלוקת CNTs.
4. Electrospinning של פולימר-CNT Composite
- להרכיב electrospinning להגדיר כפי שמוצג באיור 2. בצדו הימני של הדמות הוא מקור המתח הגבוה גלסמן. לידו עמדת תשובה עליה הפרוס סיליקון מחוברת למחשב. לשמאל הוא עוד עמדה על תשובה שהמזרק הוא רכוב ומאחוריו הוא המנורה להמחשת ההליך תוך כדי התקדמות.
- באמצעות מזרק, למשוך כמות קטנה מתערובת CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT (כ 1 מ"ל) ולעלות את המזרק על הדוכן בתשובה.
- פרוסות סיליקון היא הראד מול המזרק היטב במרחק של 10 סנטימטרים, וקליפ הקרקע של מקור המתח הגבוה קשור אליו.
- צרף קליפ נושא המתח הגבוה שיש להחיל את המחט על המזרק, לוחץ על המתג קצת (להשעות טיפה בקצה המחט) ובשלב זה, electrospinning מוכנה.
- כוח על מקור המתח הגבוה ולהתאים מטר מתח עד 10 קילו וולט. בהתאם לאופי של הפולימרים במרוכבים, מתח גבוה יותר עשוי להיות נדרש, במיוחד אם nanofibers תחת מאה ננומטרים בקוטר הם רצוי.
- רקיק נתקאת סיליקון ומקום בdessicator הלילה להתייבש לחלוטין.
5. אפיון Nanofibers
- הדמיה ראשונית של nanofibers נעשתה במיקרוסקופ אופטי להתבונן הראייה הכוללת של הסיבים.
- לנצל מיקרוסקופ אלקטרוני סורק להתבונן פרטים עדינים כמו מורפולוגיה קוטר גודל,, ממוצע נקבובי, וכו '
- להובילמתוך הדמיה נוספת עם מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לבחון טופוגרפית 3-D של סיבים, וכו '
6. ספציפי עקידת Nanofibers עם Anti-DNP IgE חלבון
- הכן את הפתרון של 4 מיקרוגרם / הליטר מסומן fluorescently, FITC-IgE (E-fluorescein Isothio cyanate-אימונוגלובולין) בפתרון PBS-BSA (פוספט Buffered אלבומין מלוח שור).
- מניח חתיכה קטנה של פרוסות סיליקון שביש nanofibers על coverslip גם מאטק. דגירת nanofibers בפתרון זה לשעה אחת. דגירה מתבצעת על ידי pipetting בעדינות החוצה, 10 פתרון IgE ul גבי פרוסות סיליקון.
- לאחר דגירה, להסיר מאוגד IgE על ידי שטיפת מדגם שלוש פעמים עם פתרון חיץ PBS-BSA. פתרון PBS הוא לוותר בעדינות על הקיר של מנת מאטק, על מנת להימנע מגמירת החיץ ישירות על nanofibers. מערבולת בעדינות את הצלחת ביד, להפצת פתרון חיץ על nanofibers. מוציא בזהירות את החיץ עם פיפטה ומחדשכבול 2 זה פעמים נוספות.
- לשליטה, דגירת nanofibers בIgG כותרת fluorescently (לא ספציפי לDNP) באותם תנאים.
- דמיינו את הסיבים הכרוכים עם confocal מיקרוסקופ כדי להתבונן מחייב עם IgE. למחקר שלנו, את המיקרוסקופ השתמש היה היקה confocal TCS SP2 עם 63x עדשה.
7. התנהגות נוכחית מתח של Nanofibers
- חיבור שני positioners מייקרו למקור זרם נמוך מאוד כמו sourcemeter הרגיש Keithley 6430. להגדיר לקביעת התנהגות המתח הנוכחית מוצג באיור 3. נתון זה מראה את תחנת הבדיקה משמשת כדי לקבוע את מאפייני IV הראשוניים של nanofibers. הוא מורכב של באוש ומיקרוסקופ MicroZoom Lomb, שלב צ'אק אבק, וארבע Micropositioners משמש בחיטוט. בפינה הימנית העליונה הוא Agilent 34405A הדיגיטלי המודד משמש במדידת המתח ומתחת לזה הוא Keithley מד מקור מרחוק 6430 תת Femtoamp משמש למקור לזרמים הנמוכים שהיו קלט לתוך הסיבים.
- הר זרועות הבדיקה של מייקר positioners על מחצלת הסיבים משני צדי מתרס עם טיפים הנוגעים בסיבים.
- חיבור שני positioners מייקרו עוד למודד דיגיטלי, עולה בבדיקה בזרועות בין שני האחרים ולהצניח את הטיפים על מחצלת הסיבים. ודא כי ארבעה טיפים הם כקוליניאריות ככל האפשר.
- קלט כמויות המשתנות של נוכחי מKeithley (בדרך כלל בטווח nanoamps).
- מדוד את מפל המתח על פני העצות החיצוניות, לכל גודל הנוכחי מקורו.
- התוויית ערכים אלה מצביעים על סוג התקן המחצלת מתנהגת כמו הסיבים.
8. נציג תוצאות
פולימרים פונקציונליים
"> השיטה לסינתזה של α, ω דו [2,4-dinitrophenyl caproic] [פולי (אתילן אוקסיד)-B-פולי (2-methoxystyrene)-B-פולי (אתילן אוקסיד)] (-CDNP-PEO P2MS-PEO-CDNP) מוצג באיור 4. 1 המבנה של הפולימר הפונקציונלי אושר על ידי FT-IR (איור 5) וH 500 MHz ספקטרוסקופית NMR 1 (איור 6). FT-IR מראה את היעלמותו המוחלטת של -OH קליטה רחבה כ -3,500 סנטימטר -1 מצביע functionalization כמותית עם קבוצת CDNP. זה גם אושר על ידי ספקטרום NMR מוצג באיור 6. שימוש בשילוב של הפסגות בספקטרום NMR, נקבע כי CDNP-PEO פולימרי P2MS-PEO-CDNP הם פונקציונליים כמותית.Nanofibers
באיור 7, מחצלת של nanofibers המוליך המתקבל על ידי electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / קלקר / SWCNT מchlorobenzene היא shעצמו. תמונות confocal מתקבלות הראו כי החלבון IgE נקשר עם DNP על פני הסיב. 3 זוהי אינדיקציה הספציפית של מחייב של פולימרי DNP electrospun כלפי נוגדני IgE. עוצמת האור היא אינדיקטור של הנוכחות של IgE על nanofibers כחלבון מתויג fluorescently.
האיור 8 א הוא תמונת מיקרוסקופ (מיקרוסקופ כוח אטומי) של אחד nanofibers את המתקבל על ידי תהליך זה ו8b איור מציג את הממד של nanofiber המסוים הזה הוא סביב 150 ננומטר בקוטר. על ידי תהליך זה סיבים בין 100-700 ננומטר מתקבלים. בשלב הנוכחי זה מאתגר להכין סיבים עם ממד מסוים. זה עולה בקנה אחד עם מה שנצפה על ידי קבוצות אחרות. 4 איור 9 מראה SEM תמונות של CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / קלקר / SWCNT nanofibers והקוטר של nanofibers היו בין 200 ננומטר ל 300 ננומטר. ישנם שלושה SEM תמונות של nanofibers מוצג בהגדלה שונה. המחקר של השלוש התמונות מציג את המורפולוגיות של הסיבים הן ליניארי וחרוזים. המטרה הכללית היא להכין סיבים שהם בעיקר ליניארי. איור 10 מציג את העלילה הרביעית של מחצלות של nanofibers הוכן מCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / קלקר / SWCNT. העלילה מציגה את התנהגותו של נגד (ohmic). כאשר אנטיגן קשור לnanofibers, אנו מצפים לראות שינוי בהתנהגות IV של סיבי שטיח שהשינוי הזה בהתנגדות הוא מאפיין המצביע על כך שהסיבים הפונקציונליים יש פוטנציאל יישום כרכיב הפעיל בחיישנים לזיהוי מולקולה בודדה .
איור 1. כור פלמור לסינתזת פולימר α, ω-dihydroxyl. א) נקודת ההזרקה לגז חנקן UHP זרימה. ב) נקודת הזרקה לממס, מונומר, ויוזם. ג) תגובת כלי.
איור 2. הגדרה משמשת לelectrospinning באמצעות מקור מתח גבוה גלסמן.
איור 3. הגדרה המשמשת למדידת חלקות IV באמצעות מרחוק Sourcemeter תת femtoamp (Keithley).
איור 4).. גישה סינטתית להכנת OH-PEO-P2MS-PEO-OH פולימרים. B) Functionalization של α, ω-dihydroxy [פולי (ethyleneoxide)-B-פולי (2-methoxystyrene)-B-פולי (ethyleneoxide)].
איור 5. ספקטרום FT-IR של () OH-PEO-P2MS-PEO-OH, מבשר CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP ו (ב) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
איור 6. 500 MHz הפרוטון NMR של CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
איור 7). תמונת עקדת FITC-IgE עם CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP electrospun סיבים מchlorobenzene. B) תמונת Confocal מיקרוסקופ של השליטה (nanofibers עם IgG).
איור 8). תמונת מיקרוסקופ כוח אטומי CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP electrospun סיבים מchlorobenzene ו-B) ממד כגון: פרופיל AFM של סיב אחד שמוצג באיור 5 א.
איור 9. תמונות SEM של CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / קלקר / SWCNT nanofibers.
איור 10. העלילה הרביעית של מחצלות של nanofibers הוכן מCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / קלקר / SWCNT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, הציג גישה חזקה להכנת nanofibers biofunctional. Nanofibers את מעוטרים לקבוצה פונקציונלית שהוא ספציפי למודל חלבון. ההליך והגישה דווחה בתקשורת זו הוא כללי בטבע ויכול לשמש להכנת nanofibers מעוטר בכל קבוצה פונקציונלית רצויה. פילמור החיים anionic הוא שיטה רבה עצמה כדי לסנתז מבני פולימר מבוקרים מחוברי קוולנטית לכל מספר של קבוצות מעניינות תפקודיות או פונקציונליות שהם ספציפיים לסמנים מסוימים של ריבית. פילמור החיים anionic הוא מבוסס היטב, למונומר 2 methoxystyrene. 2 Electrospinning הוא טכניקה תכליתית שבממדי הסיבים ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי המתח וגם משתנים ריכוז של הפתרון להיות electrospun. 5 nanofibers להראות IV התנגדות התנהגות ובכך הם מבטיחים לתפקד כרכיבים פעילים בbiosensors כלומר הגישה דיווחה טומן בחובו הבטחה לפיתוח מכשיר איתור סמן ביולוגי. 6,7
פילמור של מונומר הראשון, 2-methoxystyrene, הוא 100% הושלם בתוך 100% כלומר 40 דקות של מונומר מומר לפולימר ומונומר פילמור השני הוא איטי הדורש 2 ימים פלמר. כלומר, מונומר 1 polymerizes מהר יותר ממונומר 2. אין מונומר שאינו בשימוש אחד, אבל הסוף של 2 ימים, יש כמה מונומר שאינו בשימוש, אבל זה לא יתרום לpolydispersity. הכנו homopolymers של מונומר 1 כלומר פולי (2-methoxystyrene) ופ"ד של פולימר אלה הם סביב 1.2 וגם קופולימרים לחסום דיווחו כאן הוא גם 1.2. למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא בוצע שנראה את ההשפעה של PDI בממד של סיבי electrospun אבל זה בדרך כלל צפוי שPDI הנמוך תורם למוצר מעובד באיכות טובה יותר בגלל הסיבות של גהסתבכויות Hain שרשרת.
אנחנו השתמשנו SWCNTs בגלל העבודה הקודמת שמראה שpoly2-methoxystyrene יעיל בגלישה סביב Nanotube הפחם ולשבור את ההצטברות של SWCNT. 8 אנו מאמינים שזה קשור לגודל מסוים של SWCNTs. לבסוף, 1% תוכן SWCNT בתוצאות בסיבי סיבים שהם מספיק electroactive למחקר שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NSF HRD-0630456, NSF CREST תכנית וNSF הוא DMR-0934142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
