En protokol for forberedelse af robuste, små HeLa nukleare ekstrakter er beskrevet. Denne protokol er værdifuldt for assays, der kræver brug af små populationer af celler, såsom celler behandlet med lægemidler eller RNAi. Fremgangsmåden bør anvendes til en lang række genekspressionssystemer assays og andre celletyper, herunder patientens celler.
En stor del af fremskridt i forståelsen genekspression er blevet gjort brug af in vitro-systemer. For de fleste undersøgelser, der funktionelle assays udføres under anvendelse af ekstrakter, der er fremstillet i bulk fra 10-50 eller flere liter celler dyrket i suspension. Disse store præparater er ikke egnet til hurtigt at teste in vitro virkninger, der resulterer fra en række af in vivo cellulære behandlinger eller tilstande. Denne tidsskrift video artikel viser en fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle mindre kerneekstrakter under anvendelse af HeLa-celler som et eksempel. Denne fremgangsmåde udføres ved anvendelse af så få som tre 150 mm plader af celler dyrket som adhærente monolag. For at illustrere effektiviteten af de små ekstrakter, viser vi, at de er så aktive som bulk-nukleare ekstrakter til koblede RNA-polymerase II transskriptions / splejsning reaktioner. For at demonstrere anvendeligheden af ekstrakt-protokollen, viser vi, at splejsning er afskaffet i ekstrakter fremstillet fra HeLa-celles behandlet med splejsning inhibitoren lægemidlet E7107. Den lille skala Protokollen skal være generelt anvendelige til proces-eller celletype, der kan undersøges in vitro ved hjælp af cellulære ekstrakter. Disse omfatter patientens celler, der kun findes i begrænsede mængder eller celler udsat for en række midler, såsom lægemidler og DNA-skadende agenter, RNAi eller transfektion, som kræver brug af små cellepopulationer. Desuden er små mængder frisk dyrkede celler bekvem og / eller kræves til nogle anvendelser.
Vi har etableret en hurtig og reproducerbar metode til fremstilling af nukleare ekstrakter fra små mængder af HeLa-celler dyrket som monolag. Vi viste, at disse uddrag er robuste ved at vise, at kinetik og effektiviteten af RNAP II transskriptions / splejsning analyser er ens i de små og bulk-nukleare ekstrakter. Vi viste anvendeligheden af ekstrakterne ved at påvise, at ekstrakter fremstillet fra celler behandlet med en splejsning inhibitor lægemiddel er aktive til transkription, men defekt i splejsning.
Vores metode til fremstilling af små nukleare ekstrakter blev etableret ved at kombinere og optimere metoder, der tidligere er fastsat for at ekstrakter fra HeLa-celler dyrket i suspension i stor skala 1,8 og en metode for små-skala fremstilling af ekstrakter 9. Vi etableret vores protokol, da de foregående små ekstrakter ikke var funktionelle i nogle assays, såsom koblet transkription / splicing assay. En vigtig forskel mellem den tidligere små protokol 9 og vores er, at vi optimerede betingelser for at lysere cellerne ved anvendelse af en mini-dounce hvorimod den foregående protokol lyserede celler ved at skubbe dem gennem en lille kanyle 9. Nålen-lyse resulterer i bobler, der kan forklare, hvorfor de uddrag var inaktive og / eller vanskelige at reproducere for nogle analyser. Vi har også tilføjet en koncentration skridt til vores protokol. Dette trin forøger aktiviteten af de ekstrakter, som er meget følsomme over for koncentration og begrænser også variabiliteten mellem ekstrakter, der er uløseligt forbundet med små præparater. Endelig er vores forberedelse rutinemæssigt gennemføres med kun tre 150 mm plader af monolag af celler, uden nogen signifikant effekt på aktiviteten i forhold til bulk-ekstrakter. Således er proceduren er let modtagelig for små præparater, der kræver dyre reagenser eller begrænset celle tilgængelighed. For eksempel har vi forberedt SMAll-skala uddrag fra RNAi Knockdown celler og fra kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) patients celler og brugt disse ekstrakter til funktionelle og / eller biokemiske analyser (EGF, JLH, TY og RR, upubliceret). Vi har fundet, at ekstrakterne er værdifulde for RNAi efterfulgt af specifikke biokemiske assays, såsom immunopreciptations og Westerns og sølvfarvning. Efter etablering af effektiviteten af vælte et bestemt protein, kan en mere detaljeret undersøgelse udføres ved at foretage en stabil knockdown cellelinje, som kan anvendes til fremstilling af yderligere ekstrakter med lavere omkostninger. Massespektrometri af proteiner til stede i immunopræcipitater fra disse knockdown cellelinjer vil også være en nyttig anvendelse af fremgangsmåden. Ud over den koblede transkriptions / splejsning assay, som vi som et eksempel for vores protokol beskrivelse her, bør de små ekstrakter være generelt anvendelig til mange funktionelle og biokemiske assays, såsom dem der anvendes til forskellige stEPS i genekspression (fx capping, splejsning, transkription, polyadenylering, microRNA behandling). Protokollen kan også tilpasses til patientens celletyper, som kan enten opnås i suspension (såsom CLL-celler) eller dyrket i kultur (såsom patientens fibroblaster). Endelig bør den cytoplasmatiske fraktion opnået under proceduren være nyttigt for både funktionelle og biokemiske assays, der kræver cytoplasmaet.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng for nyttige drøftelser. HeLa-celler blev opnået fra National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Vi takker også Eisai Co, Ltd for at give E7107 og Nikon Imaging Center på Harvard Medical School for at få hjælp med lys mikroskopi. Dette arbejde blev støttet af en NIH tilskud GM043375 til RR og EGF og NRSA stipendium til JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.