Summary
Протокол для подготовки надежных, мелких HeLa ядерных экстрактов описано. Этот протокол является ценным для анализов, которые требуют использования небольших популяциях клеток, таких как клетки, обработанные с наркотиками или РНК-интерференции. Этот метод должен быть использован для широкого спектра экспрессии генов анализов и другие типы клеток, включая клетки пациента.
Abstract
Большой прогресс в понимании выражения гена были сделаны с использованием в системах пробирке. Для большинства исследований, функциональные тесты проводятся с использованием экстрактов, которые готовятся в объеме от 10-50 и более литров клетки, выращенные в виде суспензии. Тем не менее, эти крупномасштабные препараты не поддаются быстрого тестирования в лабораторных эффектов, которые в результате различных в естественных условиях сотовой лечения или условий. В этой статье журнал видео показывает способ получения функциональных мелких ядерных экстрактов с помощью клеток HeLa в качестве примера. Этот метод осуществляется с помощью всего лишь три 150 мм пластинах клеток, выращенных в качестве сторонника монослоев. Для иллюстрации эффективности небольшой выдержки, мы покажем, что они так активно, как масса ядерных экстрактов для связанной РНК-полимеразы II транскрипции / сращивания реакций. Чтобы продемонстрировать полезность экстракт протокол, мы показали, что сращивание отменена экстракты получены из клетки HeLaс получавших ингибитор сращивания наркотиков E7107. Мелкие протокол должен быть вообще применимо к любой процесс или тип клеток, которые могут быть исследованы в лабораторных использованием клеточных экстрактов. К ним относятся клетки пациента, которые доступны только в ограниченном количестве или клетки подвергаются многочисленным агентов, таких как наркотики, ДНК-повреждающих агентов, РНК-интерференции, или трансфекции, которые требуют использования небольших клеточных популяций. Кроме того, небольшое количество свежего вырос клетки удобны и / или необходимых для некоторых приложений.
Protocol
1. Рост HeLa клетки ядерных добыча
- Пластина HeLa клетки на три 150 мм пластин с DMEM среде с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина. Рост в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 до клеток на 90% вырожденная.
Tip-Разбить ячейки 1:10 от сливной пластины и урожай через 3 дня после расщепления.
Tip-дополнительные пластины могут быть выращены в случае, если нет достаточного количества клеток с тремя пластинами (например, если клетки менее 90% сливной).
2. Подготовить и холод ядерной решения Экстракт
- Подготовить свежие решения, как указано в таблице 2.
- Алиготе 10 мл гипотонического буфера в 15 мл трубку Falcon. Алиготе 1 мл буфера высокая соль и 1 мл буфера низкой соли в 1,5 мл пробирок Эппендорф. Холод буферов на льду. Добавьте соответствующие объемы PMSF и DVB-T для каждого буфера непосредственно перед использованием (см.
3. Сбор HeLa клетки ядерных добыча
- Аспирируйте средств массовой информации, из ячеек и промыть клетки один раз 13 мл комнатной температуры 1X PBS в тарелку.
- Аспирируйте стирки PBS.
Tip-Аспирируйте столько PBS возможно, сначала естественной, то стоящие плиты на свою сторону, подождать несколько секунд, и аспирационных остальных.
- Использование сотового ручка, очистить клетки нижнего края пластины, а затем передать клеткам трубки Эппендорф. Избегайте пузырей. 3 пластины соскабливают клетки должны войти в одну трубку 1,5 мл Eppendorf.
Tip-легче оценить объем клеток, если трубку Eppendorf используется. Для масштабов, используйте Сокол труб.
- Центрифуга при 4 ° С в микроцентрифуге в течение 5 мин при 100 хд в гранулах клетки.
4. Здорово HeLa клетки в Гипотоническое буфер
5. Лизировать клетки, используя Dounce Гомогенизатор
- Используйте Гипотоническое буфера для промывки Dounce, а затем охладить его на лед. Протрите сухой пестик с тонким WIP задачаэ (например, Kimwipe). Удалите оставшийся буфер из Dounce помощью расширенного 1000 мкл наконечник пипетки.
- Передача раздутые клетки в Dounce. Медленно перемещайте жесткий пестик из Dounce вверх и вниз 5 раз лизировать клетки, будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.
- Анализ для лизиса клеток с использованием 5 мкл клеток из Dounce. Поместите аликвоту в пробирку Эппендорфа и добавьте равное количество Трипановый Blue. Поставьте смесь на слайде и исследовать клетки с помощью светового микроскопа. Ядра клеток лизировали появится синий. Около 90% лизис идеально.
Tip-сколько раз клетки должны быть dounced будет варьироваться в зависимости от герметичности Dounce. При выполнении этого протокола впервые, определить количество раз Dounce путем проведения шагом 5,3 после каждого удара с Dounce. Не по-Dounce, чрезмерное douncing уничтожить ядер.
- Передача лизированных клеток предварительно chilleг Эппендорф трубы и спина в 4 ° C микроцентрифужную течение 5 минут при 1500 х г. Осадок содержит ядер. Тщательно передать супернатант в новую пробирку, не нарушая ядер. Супернатант содержит цитоплазму.
Tip-цитоплазме могут быть использованы как есть или дальнейшей переработке для S100 с помощью той же высокой скорости отжима для массовых экстрактов (см. 1 для подготовки активной S100 от объемных экстракты).
6. Солт-извлечение ядра
- Оцените Упакованные ядерной Объем (ПНВ), глядя на градации на трубе. PCV 500 мкл правило, приводит к ПНВ 400 мкл.
- Добавить ½ X ПНВ малой буфера соль с ядрами, вставив кончик пипетки на дне пробирки и медленно впрыскивая в буфер ядра, мягко смешивания. Не пипетировать вверх и вниз. Аккуратно вылить труб, чтобы убедиться, что осадок полностью ресуспендировали в буфер низкой соли, прежде чем продолжить. <LI> Добавить ½ X ПНВ высокого буфера соль и быстро перемешать 1 раз путем обращения трубки. Не трясите. Поворот на 4 ° С в течение 30 мин.
Tip-Будьте нежны с ядрами, когда они находятся в буфере с высокой ионной соли, чтобы избежать их лизиса.
- Спиновая при 4 ° С в микроцентрифуге в течение 15 мин при 18000 х г. Супернатант является высокая соль ядерный экстракт (HS-NE). Три пластины клетки обычно дают 500-600 мкл HS-северо-восток.
7. Концентрат и диализировать ядерного экстракта
- Передача 500 мкл HS-З в охлажденном мини-centricons (Amicon) и спина в течение 50 минут при 4 ° С в микроцентрифуге при 14000 х г. Обратить мини-Centricon (Amicon) и поместить его в новую пробирку Эппендорфа. Спин в течение 2 мин при температуре 4 ° C 1000 мкг восстановить HS-северо-восток. HS-СВ будет сосредоточено на приблизительно 115 мкл.
- С помощью P200 Pipetman, передавать 45 мкл аликвоты HS-З в мини-диализа Slide-A-Lyzers, и разместить их в 500 мл охлажденного буфера диализа. Убедитесь, что в нижней части Slide-A-анализатор, совмещена с нижней части поплавка. Перемешать в течение 1-2 часов при температуре 4 ° C. СВ появятся облачно после диализа.
Tip-Не центрифуги для удаления осадка облачно, которое наблюдается после диализа, так как это центрифугирование снижает активность экстракта.
- СВ можно использовать сразу или аликвоты. Порции должны быть флэш заморожены в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Н. могут быть сохранены и пройти по крайней мере два циклов замораживания-оттаивания без потери активности.
8. Представитель Результаты
В последнее время эффективных систем пробирке для соединения РНКП II транскрипции сплайсинга были разработаны 2-5. Эти системы работают HeLa клетки, выращенные в натуральном выражении и, следовательно, не поддаются быстрого тестирования воздействия специфического клеточного лечения на нескольких образцах. Исходя из этого необходимом общей полезности малого экстракт протокола (см. обсуждение), мы установили надежные небольшой ядерный метод извлечения. Представитель данные сравнения РНКП II транскрипции / сращивания реакцию в небольшой ядерный экстракт с основной ядерный экстракт показано на рисунке 2. ЦМВ ДНК-конструкцию, которая содержит CMV промотора и кодирует стандартной подложке сплайсинга (ЗСТ 3, рис 2А) был использован для анализа. При этом конструкция инкубировали в объеме (полосы 1-3) или мелкие (полосы 4-6) экстракт, такого же уровня зарождающейся пре-мРНК были синтезированы 5 мин момент времени (рис. 2, дорожки 1 и 4 ). После добавления α-аманитин блокировать дальнейшее транскрипции, сплайсинга и промежуточных продуктов сплайсинга накопленные за время с аналогичными кинетика в обоих типах выдержки (рис. 2, дорожки 2, 3, 5, 6). Эти представитель результаты показывают, что эффективность государственного переворота под руководством РНКП II транскрипции / сращивания система подобна в объеме и малых ядерных экстрактов.
Чтобы продемонстрировать полезность мелких экстракт метод, экстракты были получены из клеток HeLa обрабатывали сращивания ингибитор, E7107, или отрицательный pladienolide составного элемента управления F 6,7 и связанной РНКП II транскрипции / сращивания анализ был проведен. Как показано на рисунке 3, транскрипции РНКП II произошло эффективно готовится из экстрактов и F Pladienolide и E7107 обработанных клеток (10 очков мин времени). С другой стороны, произошло сращивание как правило, в экстракт получают из Pladienolide F-обработанных клеток, но был отменен в E7107 обработанных клеток (рис. 3, 20-60 пункта мин времени). Эти данные являются доказательством концепции для использования мелких ядерных экстрактов для специальной обработки клеток в небольших масштабах.
JPG "/>
Рисунок 1. Схема Малый экстракт протокола. Шаг P1. Клетки выращиваются как монослоев, собранных из пластин с помощью мобильного подъемника и распухли путем добавления гипотонического буфера. Шаг P2. Клетки лизировали помощью Dounce гомогенизатор и центрифугируют для осаждения ядер. Шаг Р3. Ядра отделены от цитоплазмы и пройти добычи соли. Шаг P4. Ядерный экстракт концентрируют и диализ. Шаг P5. Получены результаты, которые показывают, что ядерные экстракты функционала (см. Рисунок 2 более подробно).
Рисунок 2. Малые ядерные экстракты являются надежными в связанной РНКП II транскрипции / сращивания анализа. А. Схема ЦМВ-ЗСТ ДНК шаблон, используемый для связанных РНКП II транскрипции / сплайсинга. Промоутер ЦМВ и размеры экзонов и интронов указаны. Б. Сравнение связанных РНКПII транскрипции / сращивания методом с использованием либо объем ядерный экстракт или небольшой ядерный экстракт. α-аманитин было добавлено через 5 минут транскрипции и сплайсинга было позволено произойти в течение 30 и 60 мин. РНК выделяли и фракционированного на 5% денатурирующих полиакриламидном геле и обнаружить phosphoimager. Сплайсинга промежуточных продуктов и указаны. Эндогенный U6 snRNA и тРНК, присутствующие в экстракте и 32 P-меченых во время инкубации указаны. Смотрите 3 подробный протокол о связанной РНКП II транскрипции / сращивания системы.
Рисунок 3. Малые ядерные экстракты получены из клеток HeLa обрабатывали сращивания ингибитор наркотиков E7107 являются дефектными в сплайсинга. Клетки обрабатывали 3 Pladienolide мкМ F или, как E7107описаны 6, а затем использованы для подготовки мелких ядерных экстрактов. Время курс проводится с использованием тех же транскрипции / сращивания анализ как показано на рисунке 2. Сплайсинга промежуточных и продукты, и U6 snRNA и тРНК указаны.
Discussion
Мы создали быстрый и воспроизводимый способ получения ядерного экстракта из небольшого количества клеток HeLa выращивают как монослоев. Мы показали, что эти экстракты являются устойчивыми, показывая, что кинетика и эффективность РНКП II транскрипции / сращивания тесты похожи на мелких и сыпучих ядерных экстрактов. Мы показали полезность экстракты, продемонстрировав, что экстракты получены из клеток, обработанных с наркотиками ингибитор сплайсинга являются активными для транскрипции, но дефект склейки.
Наш способ получения мелких ядерных экстрактов была создана путем объединения и оптимизации методов ранее установленные для изготовления экстракта из клеток HeLa выращивают в суспензии в крупномасштабных 1,8 и метод для малого подготовки экстрактов 9. Мы создали наш протокол, потому что предыдущие мелкие экстракты были не работает для некоторых тестов, таких как связанных транскрипции / зрlicing анализа. Важное различие между предыдущими небольшой протокол 9 и наша в том, что мы оптимизировали условия для лизиса клеток с использованием мини-Dounce в то время как предыдущий протокол лизированных клеток толкает их через небольшую иглу 9. Иглой приводит к лизису пузырей, которые могут объяснить, почему экстракты были неактивны и / или трудно воспроизвести некоторые анализы. Мы также добавили в концентрации шаг к нашей протокола. Этот шаг повышает активность экстрактов, которые крайне чувствительны к концентрации, а также ограничивает изменчивость между экстрактов, которые присущи мелким препаратов. Наконец, наша подготовка обычно проводится только с тремя 150 мм пластин монослоя клеток, без существенного влияния на деятельность по сравнению с объемной экстрактов. Таким образом, процедура легко поддается для мелких препараты, которые требуют дорогостоящих реагентов или ограниченная доступность клетки. Например, мы подготовили SMALL-шкала выдержки из клеток RNAi нокдаун и от хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) клетки пациента, и использовать эти экстракты для функциональных и / или биохимические анализы (EGF, JLH, ТУ и РР, не опубликовано). Мы обнаружили, что экстракт ценны для RNAi следуют конкретные биохимические анализы, такие как immunopreciptations, вестерны, и серебрения. После установления эффективности сбить с особым белком, более детальное исследование может быть осуществлено путем стабильного нокдаун клеточных линий, которые могут быть использованы для получения дополнительной выдержки при меньших затратах. Масс-спектрометрия белков, присутствующих в иммунопреципитатах, полученные из этих линий нокдаун ячейка также будет полезно применение метода. В дополнение к связанной транскрипции / сращивания анализ, который мы использовали в качестве примера для наших протокол описание здесь небольшой выдержки должно быть вообще применимо к многочисленным функциональным и биохимические анализы, такие, как те, которые используются для различных гоEPS в экспрессии генов (например, укупорки, сплайсинг, транскрипция, полиаденилирования, микроРНК обработки). Протокол также может быть адаптирована для пациента типов клеток, которые могут быть получены либо в виде суспензии (таких, как ХЛЛ клеток) или выращенные в культуре (например, пациент фибробластов). Наконец, в цитоплазматической фракции, полученные в ходе процедуры должны оказаться полезными как для функциональных и биохимических анализов, которые требуют от цитоплазмы.
Disclosures
Производство и свободного доступа к этой статье спонсируется Abcam, Plc.
Acknowledgments
Мы благодарны М. Winkelbauer-Херт, Е. Ибрагим, П. Валенсии, К. Dufu, H. Cheng за полезные обсуждения. HeLa клетки были получены из Национального центра культуры клеток (Миннеаполис, Миннесота). Мы также благодарим Eisai Co, Ltd для обеспечения E7107 и Nikon Imaging центр в Гарвардской медицинской школе за помощью световой микроскопии. Эта работа была поддержана грантом NIH GM043375 руб и EGF и НРСА общение с JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
