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Bioengineering

Les petites et Wide Angle études diffraction des rayons X de macromolécules biologiques en solution

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

La démonstration de l'angle très faible et large diffusion des rayons X (SWAXS) procédure est devenue contribué à l'étude des macromolécules biologiques. Grâce à l'utilisation de l'instrumentation et des procédures de méthodes de préparation et d'angle spécifiques, les données expérimentales de la SWAXS affiche la caractérisation atomique et nano-échelle de macromolécules.

Abstract

Dans cet article, les petites et Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) l'analyse des macromolécules est démontrée par l'expérimentation. SWAXS est une technique dans laquelle les rayons X sont diffusés élastiquement par un échantillon non homogène dans la gamme nm aux petits angles (typiquement de 0,1 à 5 °) et des angles larges (typiquement> 5 °). Cette technique fournit des informations sur la forme, la taille et la distribution des macromolécules, les distances caractéristiques de matériaux partiellement ordonnés, tailles de pores et surface-volume élevé. Petit angle X-ray Scattering (SAXS) est capable de fournir des informations de structure de macromolécules entre 1 et 200 nm, tandis que le grand angle X-ray Diffraction (WAXS) peut résoudre encore plus faible espacement entre les échantillons de Bragg 0,33 nm et 0,49 nm sur la base de l' configuration spécifique du système et le détecteur. La distance est déterminée à partir de la loi de Bragg et est fonction de la longueur d'onde et angle d'incidence.

Dans une expérience SWAXS, les matériaux peuvent être solidesou liquide, ou contenir des solides, liquides ou gazeux domaines (dites particules) de la même matière ou d'une autre dans une combinaison quelconque. SWAXS applications sont très larges et comprennent des colloïdes de tous types: métaux, composites, ciment, pétrole, les polymères, les plastiques, les protéines, les aliments et les produits pharmaceutiques. Pour des échantillons solides, l'épaisseur est limitée à environ 5 mm.

L'utilisation d'un instrument de laboratoire à base de SWAXS est détaillé dans cet article. Avec les logiciels disponibles (par exemple, GNOM-ATSAS 2,3 paquet par D. Svergun EMBL-Hambourg et logiciels EasySWAXS) pour le système SWAXS, une expérience peut être menée afin de déterminer certains paramètres d'intérêt pour l'échantillon donné. Un exemple d'une expérience macromolécule biologique est l'analyse de 2% en poids de lysozyme dans un tampon aqueux à base d'eau qui peut être choisi et préparé par diverses méthodes. La préparation de l'échantillon respecte les directives ci-dessous dans la section Préparation des échantillons. Par l'expérimentation SWAXS,importantes des paramètres structurels du lysozyme, par exemple, le rayon de giration, peut être analysée.

Protocol

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1. Préparation de l'échantillon

  1. Utilisez une aiguille pour enlever une partie de l'échantillon du récipient d'échantillon. *
  2. Utilisez l'aiguille pour remplir le capillaire (diamètre maximum de 2,2 mm) avec l'échantillon. Le capillaire doit être rempli entre 2 et 3 cm du fond.
  3. Fermez le capillaire par fondre la cire sur sa pointe.
  4. Dévisser le porte-échantillon vide du système.
  5. Prenez le capillaire par l'extrémité fondue (fin de la cire) et insérer l'extrémité non fondu dans le porte-échantillon.
  6. Placez le support dans le système et la vis en place.

* Les échantillons solides (y compris les échantillons de poudre) peut être directement placé dans le porte-échantillon (pas nécessaire capillaire), tandis que les échantillons liquides doivent être placés dans un capillaire.

Démarrage de la machine SWAXS

2. Procédure de démarrage à froid Source

  1. Fermez l'obturateur en appuyant sur le bouton de l'obturateur de sécurité.
  2. Coupez l'alimentation principale«ON» en appuyant sur le bouton vert.
  3. Vérifiez l'état d'urgence "Shut-Off" est dans la position étendue.
  4. Mettez l'appareil sous tension en appuyant sur le bouton vert.
  5. Vérifier que le voyant de verrouillage s'allume en vert, indiquant tous les verrouillages sont ok.
  6. Attendez que l'écran tactile à charger. Une fois qu'il a chargé, appuyez sur "R6" dans le menu.
  7. Tournez la clé à la veille position "ON".
  8. Tournez la clé à rayons X pour la position "ON". Le rouge aux rayons X de la lumière devrait s'allumer.
  9. Attendez que l'écran tactile pour lire les niveaux d'attente (30 kV et 0,4 mA).
  10. Tournez la clé de sécurité veille à la position «OFF». Appuyez sur la touche "Cycle Start" en bas de l'écran tactile.
  11. Attendez que l'écran tactile pour lire la puissance nominale (50 kV et 1 mA). Si un niveau de puissance différent est souhaité, entrez dans l'écran de configuration en appuyant sur «R4» sur l'écran tactile et d'entrer les paramètres souhaités.

3. Procédure refroidisseur

  1. Tournez le pouvoir switch à la position «ON» sur le panneau de contrôle de la température. Un voyant de contrôle et l'affichage LED de la température s'allume.
  2. Tournez le commutateur d'alimentation sur la position "ON" sur le refroidisseur.
  3. Attendez jusqu'à ce que la température affichée est "OFF". Ceci est en mode veille.
  4. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton Enter (symbole de retour) pendant environ 4 secondes ou jusqu'à ce que l'affichage de température indique une température réelle.
  5. Pour modifier la température, appuyez sur le haut ou flèche vers le bas. La valeur de consigne sera montré sur l'affichage de la température pendant environ 8 secondes avant qu'il ne retourne à la valeur réelle.
  6. Appuyez sur la touche ENTER une fois la valeur désirée s'affiche. Cela permettra de stocker cette valeur.
  7. Attendez que la température réelle atteint la valeur de consigne souhaitée.

REMARQUE: Si, à un moment où l'erreur "E 01" apparaît sur ​​l'affichage de la température, suivez les instructions d'arrêt du refroidisseur, remplir à nouveau bain en versant de l'eau purifiée dans le réservoir de fill, puis effectuer la procédure de démarrage refroidisseur à nouveau.

4. Arrêt du refroidisseur

  1. Appuyez sur "enter" pour environ 4 sec.
  2. Mettez l'interrupteur d'alimentation à la position «OFF».

5. Mise sous tension du vide

  1. S'assurer que la porte vide est maintenu en place.
  2. Tournez le vide 1 et 2 boutons pour les positions "ON".
  3. Attendez jusqu'à ce que la jauge à vide VAP5 lit un niveau de vide inférieur à 1,5 mbar.

6. Configuration du système de détection

  1. Pour configurer la pression du gaz, vérifiez le manomètre principal de la valve de réduction est d'au moins 10 bars.
  2. Ouvrez la vanne principale.
  3. Ouvrez lentement la valve de pression de fonctionnement jusqu'à ce que la pression atteint 8 bars à la jauge de pression de fonctionnement.
  4. Ouvrez la seconde valve principale
  5. Pour régler le débit de gaz, ouvrez la soupape principale en tournant le bouton vers la position verticale sur le panneau de contrôle de gaz.
  6. Régler le débittaux avec le pointeau jusqu'à ce que le manomètre indique environ 8 bars.
  7. Mettez l'interrupteur d'alimentation principale en position "ON". La lumière LED doit s'allumer.
  8. Pour régler la haute tension, activez la haute tension en tournant le sélecteur sur la position "ON". La lumière LED doit s'allumer.
  9. Tourner lentement le bouton de commande de tension jusqu'à 3.5kV environ est atteint sur la jauge. NE PAS DEPASSER 4 kV.

7. Étalonnage

  1. Les étapes expérimentales ci-dessus sont effectuées sur un échantillon de pics connus.
  2. 3,3 ASA est utilisé pour obtenir le graphique de l'intensité par rapport à chaîne avec 5 sommets.
  3. Allez à Menu → Options → Entrez les canaux et les intensités correspondantes.
  4. Aller à la ASA3, "TPF" premier onglet.
  5. Changer le filtre, en haut à gauche 1 mm Nickel (filtre de faisceau).
  6. Régler la position 32.000 (28.000 à 32.000 gamme, zone critique autour de 28.000) → allez à la poste, faire le vide sûr, c'est inférieur à 5 mbar, assurez-vous que le détecteur est raisonnableding entre 1k-10K.
  7. Course à 10 sec pour environ 52 coups par seconde.
  8. Changer les fenêtres de l'énergie, (ou de mesurer la fenêtre d'énergie avec l'échantillon seulement, non compris le boîtier de filtre). Régler la course finale pendant 10 sec.
  9. Trouver l'emplacement du faisceau primaire (233 canal par exemple).
  10. Pour d'autres essais, changement de filtre à nouveau pour 2 Tungstène mm (W, faisceau bouchon) et à partir de 30.000.
  11. Trouvez l'emplacement de tous les autres pics des échantillons.
  12. Utiliser ImageJ-macro logiciel pour calibrer SAXS - les transitions à partir de l'intensité par rapport à l'intensité de canal par rapport à q (ou de l'espacement d) (figure 1).
  13. Utiliser ImageJ-macro logiciel pour calibrer WAXS - les transitions à partir de l'intensité par rapport à l'intensité de canal par rapport à q (ou de l'espacement d) (figure 2).

8. Procédure logiciel

  1. Utilisez le logiciel ASA 3.3, pour recueillir les données en direct: Live Data → → TPF onglet Enregistrer le fichier.
  2. Pour EasySWAXS, cliquez sur onglet Paramètres du périphérique.
  3. Saisir le "a", lambda, et d valeurs, ainsi que le centre de gravité.
  4. Sélectionnez Collimation Point.
  5. Sélectionnez le type de particules globulaires (sauf si c'est un connu pour être une tige de particules en forme de plat).
  6. Cliquez sur l'onglet Guinier-Terrain. Un je vs q 2 graphique s'affiche.
  7. Faites glisser les lignes verticales pour entourer une partie de la pente à peu près linéaire.
  8. Au bas de l'écran, une valeur de R est affiché. A côté de cela, il ya une exigence de validation.
  9. Continuer à faire glisser les lignes verticales se rapprocher jusqu'à ce que la valeur de validation est comprise entre 1 et 2. Ceci est subjective. La valeur R ou rayon de giration, obtenu est une estimation.

9. Procédure d'arrêt source

  1. Vérifier l'innocuité et obturateurs rapides sont fermés.
  2. Tournez la clé à la veille position "ON".
  3. Attendez que l'écran tactile pour lire les niveaux de veille.
  4. Presse R5 sur le touchscreen.
  5. Réduire le courant à 0 A.
  6. Réduire la tension à 0 A.
  7. Tournez la clé à rayons X pour la position «OFF».
  8. Coupez l'alimentation principale "OFF" en appuyant sur le bouton d'arrêt rouge.

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Representative Results

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SAXS et WAXS tout peut fournir des informations de structure de l'échantillon au travers des paramètres suivants: le rayon de giration granulométrie, et la forme, facteur de structure de la solution, la surface spécifique interne et la taille des pores, de type treillis et les dimensions, et la densité d'électrons 1. SAXS et WAXS peut également être appliquée à l'étude de 2 dynamique des protéines.

Les informations de structure d'expériences SWAXS est obtenu en comparant les spectres détectés expérimentalement et les résultats de calcul du système. Les résultats des calculs ont été calculés dans le logiciel avec un potentiel effectif raisonnable V eff (r) développé à partir de modèles de mécanique statistique, comme le Ornstein-Zernike (OZ) théorie des équations intégrales (un exemple d'une telle analyse peut être vu à partir Réf. 3) .

Dans le cadre des méthodes d'analyse des données, des modèles pour l'intensité absolue SWAXS I (q) devront être mis au point dans le logiciel pour l'étude, où l'intensité de diffusion, I (q), est une fonction de la transmission d'impulsion dans l'espace réciproque, le vecteur de diffusion Q = 4π sin (θ / 2) / λ. q est une grandeur scalaire qui est reliée à l'angle de diffusion, θ, et la longueur d'onde du rayonnement, λ. q se situe dans l'intervalle de 0,03 à 0,6 Å -1 dans une expérience typique SAXS avec un échantillon choisi au détecteur de distance. La taille de la région étudiée dans l'espace réel est lié à Q par r = 2π / q, et se situe dans la plage de 11-2000 Å 4. WAXS, d'autre part, peut résoudre un espacement plus de 3,3 Å. I (q) dépend des caractéristiques atomiques et la position des centres de diffusion atomique. Dans l'expérience SWAXS, d'abord l'intensité mesurée vs canal doit être étalonné à l'intensité par rapport à q ou distance d (figure 1 et

Un exemple de l'analyse SAXS du lysozyme dans 2% d'eau en poids tampon à base aqueuse est illustré à la figure 3. La valeur de rayon de giration obtenus et montre la figure 3 compare bien à la valeur attendue de 5 nm environ 1,44. D'autres exemples de la façon d'appliquer SAXS à des macromolécules biologiques peuvent être trouvés à partir Refs. 6-13. Un exemple de l'analyse WAXS du liposome dispersé dans la solution aqueuse est représenté sur la figure 4. Les sommets équidistants décroissantes avec l'augmentation de q, confère au liposome dans l'eau une solution d'échantillon à base aqueuse sur une structure lamellaire. Avec chaque lamelle, il ya une diminution de la dispersion qui se produit.

Figure 1
Figure 1. L'étalonnage SAXS avec ImageJ-macro logiciel. L'échantillon utilisé est le stéarate d'argent avec espacement d 48,68 Å. Le faisceau primaire est situé sur le canal 367 et les cinq pics principaux (paramètres de maille ou de l'échantillon) sont situées à 539, 717, 896, 1075, 1253 et canaux, respectivement.

Figure 2
Figure 2. WAXS-COURBE D'ETALONNAGE avec le logiciel ImageJ-macro. L'échantillon utilisé est para-bromo poudre de l'acide benzoïque. Les six sommets (ou paramètres de maille de l'échantillon) sont situées à 130, 484, 555, 613, 657, et 902 canaux, respectivement.

Figure 3
Figure 3. Background-SAXS soustraites des données brutes de lysozyme (2% en poids). Le Guinier-terrain à partir du logiciel EasySWAXS peut utiliser la très faible q

Figure 4
La figure 4. Soustraits de fond WAXS premières données de liposome-dispersé dans une solution aqueuse à base d'eau est représenté sur la figure 4A. Les schémas de la structure du liposome (lamellaire 1D), sa tête hydrophile et une queue hydrophobe, sa pile membrane phospholipidique, et sa fonction de densité d'électrons sont présentés dans la figure 4B. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

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La procédure comparative du système SWAXS permet de nombreuses variables à déterminer à partir de l'analyse expérimentale. Les paramètres qui sont obtenus à partir de l'analyse peut être utilisée à différentes fins selon l'échantillon et montage expérimental. SAXS fournit des informations sur la nano-échelle de la taille et de la forme de l'objet, alors que WAXS se concentre sur la structure atomique et micro-échelle (par exemple, réseau moléculaire, la symétrie dimensions de l'unité cellulaire). Plus précisément, pour les particules dans des solutions diluées, SAXS peuvent étudier le rayon de giration, la taille des particules, et la forme, car à haute densité des échantillons, SAXS peut étudier le facteur de structure de la solution, car les systèmes de phase aléatoires poreux / 2, SAXS peuvent étudier spécifiques surface intérieure et la taille des pores et des échantillons cristallins liquides, WAXS peut étudier les dimensions et la structure en treillis maille. Toutefois, une limitation de SWAXS qu'il existe un large éventail de la distribution des tailles de particules ou de polydispersité sera sévèrement downgrade les résultats expérimentaux.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Dr Manfred Kriechbaum de Hecus XRS et l'Institut de biophysique et de la recherche nanosystèmes à l'Académie autrichienne des sciences à Graz, en Autriche. LL et XW ont été en partie soutenue par US Department of Energy, sous NERI-C sentence n ° DE-FG07-07ID14889, et US Nuclear Regulatory Commission, en vertu de l'adjudication N º CNRC-38-08-950. L'instrument SWAXS est également soutenue en partie par US Department of Energy, sous sentence n ° DE-NE0000325.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Les petites et Wide Angle études diffraction des rayons X de macromolécules biologiques en solution
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Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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