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Bioengineering

Kleine und Wide Angle X-Ray Scattering Studium der biologischen Makromolekülen in Lösung

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

Die Demonstration der kleinen und Weitwinkel-Röntgenstreuung (SWAXS) Verfahren hat sich in der Studie von biologischen Makromolekülen instrumental. Durch die Verwendung der Instrumente und Verfahren der spezifische Winkel Methoden und Zubereitung, zeigt die experimentellen Daten der SWAXS die atomare und nanoskalige Charakterisierung von Makromolekülen.

Abstract

In diesem Papier wird Klein-und Weitwinkel-X-ray Scattering (SWAXS) Analyse von Makromolekülen durch Experimentieren unter Beweis gestellt. SWAXS ist eine Technik, bei der Röntgenstrahlen elastisch durch eine inhomogene Probe im nm-Bereich bei kleinen Winkeln (typischerweise 0,1 - 5 °) verteilt sind und große Winkel (typischerweise> 5 °). Diese Technik liefert Informationen über die Form, Größe und Verteilung der Makromoleküle charakteristischen Abstände der teilweise geordneten Materialien, Porengrößen und Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) fähig ist, liefert strukturelle Informationen von Makromolekülen zwischen 1 und 200 nm, wohingegen Weitwinkel Röntgenkleinwinkelstreuung (WAXS) kann auch kleinere Bragg Abstands von Samples zwischen 0,33 nm und 0,49 nm aufzulösen basierend auf dem spezifischen System-Setup und Detektor. Der Abstand wird vom Braggschen bestimmt und hängt von der Wellenlänge und Einfallswinkel.

In einer SWAXS Experiment können die Materialien festoder flüssig sein und darf feste, flüssige oder gasförmige Domänen (sogenannte Teilchen) aus dem gleichen oder einem anderen Material in einer beliebigen Kombination. SWAXS Anwendungen sind sehr breit und umfassen Kolloiden aller Art: Metalle, Verbundwerkstoffe, Zement, Öl, Polymere, Kunststoffe, Proteine, Lebensmittel und Pharmazeutika. Für feste Proben wird die Dicke auf ungefähr 5 mm begrenzt.

Die Verwendung von einem Labor-basierte SWAXS Instrument wird in diesem Papier beschrieben. Mit der verfügbaren Software (zB GNOM-ATSAS 2,3 Paket von D. Svergun EMBL-Hamburg und EasySWAXS Software) für die SWAXS System kann ein Experiment durchgeführt, um bestimmte Parameter von Interesse für die gegebene Probe zu bestimmen. Ein Beispiel für ein biologisches Makromolekül Experiment ist die Analyse von 2 Gew.% Lysozym in einer auf Wasser basierenden wässrigen Puffer, der gewählt werden kann und hergestellt durch zahlreiche Methoden. Die Vorbereitung der Probe folgt den Richtlinien unten in der Vorbereitung der Probe Abschnitt. Durch SWAXS Experimentieren,Wichtige Strukturparameter von Lysozym, zB der Gyrationsradius, analysiert werden.

Protocol

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Ein. Vorbereitung der Probe

  1. Mit einer Nadel, einen Teil der Probe aus dem Probenbehälter zu entfernen. *
  2. Verwenden Sie die Nadel in die Kapillare zu füllen (maximaler Durchmesser von 2,2 mm) mit der Probe. Die Kapillare muss zwischen 2 und 3 cm vom unteren Rand gefüllt.
  3. Schließen Sie die Kapillare durch schmelzendes Wachs auf seiner Spitze.
  4. Lösen Sie das Vakuum Probenhalter aus dem System.
  5. Nehmen Sie die Kapillare durch das geschmolzene Ende (Wachs Ende) und legen Sie die un-fusionierten Ende in den Probenhalter.
  6. Setzen Sie den Halter wieder in das System und festschrauben.

* Feste Proben (einschließlich Pulverproben) direkt in den Probenhalter (keine Kapillarwirkung erforderlich) abgegeben werden, während flüssige Proben in einer Kapillare gestellt werden müssen.

Start-Up des SWAXS Maschine

2. Quelle Kalten Startup Procedure

  1. Schließen Sie den Auslöser, indem die Sicherheit Auslöser.
  2. Schalten Sie den Hauptschalter"ON", indem Sie die grüne Taste.
  3. Überprüfen Sie die Emergency "Shut-Off"-Taste in der ausgefahrenen Position.
  4. Schalten Sie den Netzschalter ein, indem Sie die grüne Taste.
  5. Überprüfen Sie die Verriegelung LED-Licht ist grün und zeigt alle Verriegelungen sind ok.
  6. Warten Sie auf den Touchscreen, um zu laden. Sobald es geladen ist, drücken Sie die "R6" auf der Speisekarte.
  7. Schalten Sie die Standby-Taste auf "ON"-Position.
  8. Drehen Sie den X-ray Key auf "ON"-Position. Das rote X-ray Licht sollte leuchten.
  9. Warten Sie auf den Touchscreen, um Standby-Ebenen (30 kV und 0,4 mA) zu lesen.
  10. Drehen Sie den Standby Sicherheit Key auf "OFF"-Position. Drücken Sie die "Start Cycle"-Taste auf der Unterseite des Touchscreens.
  11. Warten Sie auf den Touchscreen, um Nennleistung (50 kV und 1 mA) zu lesen. Wenn eine andere Leistung gewünscht wird, geben Sie das Konfigurationsfenster mit "R4" auf dem Touchscreen und Eingabe der gewünschten Einstellungen.

3. Chiller Procedure

  1. Schalten Sie das Gerät switch auf die "ON" Position auf der Temperatur Bedienfeld. Eine Kontrollleuchte und die LED-Temperaturanzeige leuchtet.
  2. Schalten Sie den Netzschalter auf die Position "ON" auf dem Kühler.
  3. Warten Sie, bis die Temperatur auf der Anzeige "OFF". Dies ist Standby-Modus.
  4. Drücken und halten Sie die Enter-Taste (Return-Symbol) für ca. 4 Sek. oder bis der Temperatur-Anzeige zeigt eine aktuelle Temperatur.
  5. Um die Temperatur zu ändern, drücken Sie die Aufwärts-oder Abwärtspfeil. Der Sollwert wird über die Temperaturanzeige für ca. 8 Sek. angezeigt werden, bevor es mit dem tatsächlichen Wert zurückkehren.
  6. Drücken Sie die Enter-Taste, sobald die gewünschte Sollwert angezeigt wird. Dieser speichert diesen Wert.
  7. Warten Sie, bis die tatsächliche Temperatur erreicht den gewünschten Sollwert.

HINWEIS: Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Fehlermeldung "E 01" zeigt sich auf der Temperaturanzeige, folgen Sie den Chiller Shutdown Anweisungen, füllen das Bad-Einheit durch Gießen gereinigtes Wasser in den Tank fill, und führen Sie dann den Kühler Startup Prozedur erneut.

4. Shutdown der Chiller

  1. Drücken Sie "Enter" für ca. 4 Sekunden.
  2. Schalten Sie den Netzschalter auf die Position "OFF".

5. Einschalten des Vakuum-

  1. Stellen Sie sicher, das Vakuum Tür an Ort und Stelle gesichert ist.
  2. Schalten Sie das Vakuum 1 und 2 Knöpfe, um den "ON"-Position.
  3. Warten, bis die VAP5 Vakuummeter liest ein Vakuum von weniger als 1,5 mbar.

6. Detector System Setup

  1. So richten Sie den Gasdruck, ob der Main-Manometer der Reduktion Ventil mindestens 10 bar.
  2. Öffnen Sie das Hauptventil.
  3. Öffnen Sie langsam das Operating Pressure Valve, bis der Druck 8 bar an der Operating Pressure Gauge.
  4. Öffnen Sie das zweite Hauptventil
  5. Um Gasstrom einzustellen, öffnen Sie das Hauptmenü Druckventil durch Drehen des Knopfes in die vertikale Position auf dem Gas Control Panel.
  6. Die Durchflussmengesich mit dem Nadelventil bis der Überdruck liest ca. 8 bar.
  7. Schalten Sie den Netzschalter auf "ON"-Position. Das LED-Licht aufleuchten.
  8. Um die hohe Spannung einzustellen, aktivieren Sie die hohe Spannung durch Drehen der Schalter in die Stellung "ON". Das LED-Licht aufleuchten.
  9. Drehen Sie langsam die Spannung Regler bis etwa 3,5 kV am Manometer erreicht wird. NICHT MEHR 4kV.

7. Kalibrierung

  1. Die experimentellen obigen Schritte werden mit einer Probe bekannter Peaks durchgeführt.
  2. ASA 3,3 wird verwendet, um Graphen der Intensität vs Kanal mit 5 Gipfeln zu erhalten.
  3. Öffnen Sie Menü → Optionen → Geben Kanäle und entsprechenden Intensitäten.
  4. Zum ASA3 "TPF" Registerkarte erste.
  5. Filter ändern, links oben 1 mm Nickel (Strahl-Filter).
  6. Setze die Position 32.000 (Bereich 28.000 bis 32.000, kritische Region rund 28.000) → Gehe zu Position, stellen Sie sicher Vakuum unter 5 mbar, stellen Sie sicher, der Detektor reading zwischen 1k-10K.
  7. Führen Sie für 10 Sekunden für ca. 52 Impulse pro Sekunde.
  8. Ändern Sie den Energie-Fenster (oder messen die Energie-Fenster mit der Probe nur, ohne den Filter Fall). Stellen Sie den Finallauf für 10 sec.
  9. Suchen Sie den Speicherort des Primärstrahls (Kanal 233 zum Beispiel).
  10. Für andere läuft, ändern filtern wieder auf 2 mm Tungsten (W, Strahl-Stopper) und ab 30.000.
  11. Finden Sie die Lage aller anderen Peaks der Proben.
  12. Verwenden ImageJ-Makro-Software SAXS kalibrieren - beim Übergang von Intensität vs Kanal Intensität vs q (oder d-Abstand) (Abbildung 1).
  13. Verwenden ImageJ-Makro-Software WAXS kalibrieren - beim Übergang von Intensität vs Kanal Intensität vs q (oder d-Abstand) (Abbildung 2).

8. Software Procedure

  1. Verwenden Sie die Software ASA 3,3, um die Live-Daten sammeln: Live Data → TPF Registerkarte → Datei speichern.
  2. Für EasySWAXS, auf der Registerkarte Geräteeinstellungen klicken.
  3. Geben Sie die "a", Lambda-und d-Werte sowie das Zentrum der Schwerkraft.
  4. Punkt auswählen Kollimation.
  5. Wählen Kugelsternhaufen Teilchensorte (es sei denn, es ist ein bekannt, dass ein Stab von flach geformten Teilchen sein soll).
  6. Klicken Sie auf die Guinier-Plot Registerkarte. Ein I vs q 2 graph wird angezeigt.
  7. Ziehen Sie die vertikalen Linien zu umgeben einen Teil der annähernd lineare Steigung.
  8. An der Unterseite des Bildschirms wird ein R-Wert angezeigt werden. Neben diesem gibt es eine Validierung erforderlich.
  9. Weiterhin die vertikalen Linien näher zusammen ziehen, bis die Validierung Wert liegt zwischen 1 und 2. Dies ist subjektiv. Der R-Wert oder Trägheitsradius, erhält man eine Schätzung.

9. Quelle Shutdown Vorgehensweise

  1. Überprüfen Sie die Sicherheit und schnelle Fensterläden geschlossen sind.
  2. Schalten Sie die Standby-Taste auf "ON"-Position.
  3. Warten Sie auf den Touchscreen, um Standby-Ebenen lesen.
  4. Presse R5 auf der touchscreen.
  5. Reduzieren Sie den Strom auf 0 A.
  6. Reduzieren Sie die Spannung auf 0 A.
  7. Drehen Sie den X-ray-Taste, um die "OFF"-Position.
  8. Schalten Sie den Hauptschalter auf "OFF", indem Sie den roten Aus-Taste.

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Representative Results

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Der Trägheitsradius, Partikelgröße und-form, Struktur in Lösung Faktor, spezifische innere Oberfläche und Porengröße, Gitter Art und Dimension, und der Elektronendichte 1: SAXS und WAXS insgesamt können strukturelle Informationen der Probe durch die folgenden Parameter. SAXS und WAXS kann auch auf die Untersuchung von Protein Dynamik 2 angewendet werden.

Die Strukturinformationen SWAXS Experimenten wird durch Vergleich der experimentell nachgewiesen Spektren und die rechnerischen Ergebnisse des Systems erhalten. Die Berechnungsergebnisse in der Software mit einem vernünftigen effektive Potential V eff (r) aus der statistischen Mechanik Modellen, wie dem Ornstein-Zernike (OZ) Integralgleichung Theorie (ein Beispiel einer solchen Analyse kann aus Ref. gesehen werden. 3), berechnet .

Im Rahmen der Datenanalyse Methoden, Modelle für die SWAXS absolute Intensität I (q) müssen in der Software für die Studie, entwickelt werden, wo die Streuintensität, I (Q), ist eine Funktion der Impulsübertrag im reziproken Raum, der Streuvektor q = 4π sin (θ / 2) / λ. q eine skalare Größe, die der Streuwinkel θ, und die Wellenlänge der Strahlung, λ verbunden ist. q liegt im Bereich von 0,03 - 0,6 Å -1 in einem typischen Experiment mit einer SAXS ausgewählten Probe-zu-Detektor-Abstand. Die Größe des Bereichs im realen Raum zu untersuchende q durch r = 2π / q verwandt, und liegt im Bereich von 11 bis 2000 Å 4. WAXS, auf der anderen Seite kann beheben Abstand größer als 3,3 Å aufweist. I (q) hängt von den atomaren Eigenschaften und die Lage der atomaren Streuzentren. In der SWAXS Experiment wird zunächst die gemessene Intensität vs Kanal muss, um die Intensität vs q oder Abstand d kalibriert werden (Abbildung 1 und

Ein Beispiel für die Analyse des SAXS Lysozym in 2 Gew.% Wasser basierenden wässrigen Puffers ist in Abbildung 3 dargestellt. Der Wert für Trägheitsradius erhalten und in Abbildung 3 vergleicht schön zu dem erwarteten Wert von etwa 1,44 nm 5. Weitere Beispiele dafür, wie SAXS biologische Makromoleküle gelten können von Refs gefunden werden. 13.6. Ein Beispiel für die WAXS Analyse der Liposomen-Dispersion in wässriger Lösung ist in Abbildung 4 dargestellt. Die äquidistanten Peaks nimmt mit zunehmender q, verleiht das Liposom im Wasser basierende wässrige Lösung Probe zu einer Lamellenstruktur. Mit jeder Lamellen besteht eine Abnahme der Streuung, die auftreten wird.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die SAXS Kalibrierung mit ImageJ-Makro-Software. Die verwendete Probe ist Silberstearat mit Abstand d 48,68 Å. Der primäre Strahl wird am Kanal 367 angeordnet und die fünf Hauptpeaks (oder Gitterparameter der Probe) werden bei 539 befindet, 717, 896, 1075, und 1253 Kanäle.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die WAXS-Callibration mit dem ImageJ-Makro-Software. Die verwendete Probe ist Para-Bromo Benzoesäure Pulver. Die sechs Hauptpeaks (oder Gitterparameter der Probe) werden bei 130, 484, 555, 613, 657, und 902 Kanäle, jeweils.

Abbildung 3
Abbildung 3. Background-Abzug SAXS Rohdaten von Lysozym (2 Gew.%). Die Guinier-Plot aus EasySWAXS Software nutzen die sehr niedrigen q

Abbildung 4
Abbildung 4. Hintergrund-subtrahierten WAXS Rohdaten von Liposomen dispergiert in einer wässrigen Lösung auf Wasserbasis ist in 4A gezeigt. Die schematischen Darstellungen der Struktur der Liposomen (1D lamellar), seine hydrophilen Kopf und hydrophoben Schwanz, seine Phospholipidmembran Stapel, und seine Elektronendichte Funktion sind in 4B gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

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Die vergleichende Prozedur des SWAXS System ermöglicht zahlreiche Variablen aus experimentellen Analyse bestimmt werden. Die Parameter, die aus der Analyse erreicht werden kann für verschiedene Zwecke gemäß der Probe und Versuchsaufbau verwendet werden. SAXS liefert Informationen über nanoskaligen Größe und Form des Objekts, während WAXS konzentriert sich auf die atomaren und Mikromaßstab Struktur (zB Molekülgitter, Elementarzelle Dimension Symmetrie). Genauer gesagt, für Partikel in verdünnten Lösungen können SAXS studieren Trägheitsradius, Partikelgröße und Form, für High-Density-Proben, SAXS kann die Struktur Faktor der Lösung zu studieren; für zufällige poröse / 2-Phasen-Systeme, SAXS studieren kann spezifische innere Oberfläche und Porengröße und für flüssigkristalline Proben kann WAXS studieren Gitterdimensionen und die Einheit Zellstruktur. Allerdings ist eine Beschränkung der SWAXS, dass eine breite Palette von Korngrößenverteilung bzw. Polydispersität wird schwer downgrAde die experimentellen Ergebnisse.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Herrn Dr. Manfred Kriechbaum der Hecus XRS und dem Institut für Biophysik und Nanosystemforschung an der Österreichischen Akademie der Wissenschaften in Graz, Österreich bedanken. LL und XW wurden zum Teil durch US-Department of Energy unterstützt unter NERI-C-Award DE-FG07-07ID14889 und US Nuclear Regulatory Commission, unter Preis-Nr NRC-38-08-950. Die SWAXS Instrument wird zum Teil auch durch die US Department of Energy unterstützt unter Awards DE-NE0000325.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kleine und Wide Angle X-Ray Scattering Studium der biologischen Makromolekülen in Lösung
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Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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