Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

溶液中の生体高分子の小型·広角X線散乱による研究

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

小さいと広角X線散乱(SWAXS)プロシージャのデモンストレーションは、生体高分子の研究に尽力さとなっています。特定の角度の方法と準備の計装および手順を使用することにより、SWAXSからの実験データは、巨大分子の原子とナノスケールの特性を表示します。

Abstract

本論文では、高分子の小型広角X線散乱(SWAXS)分析は、実験によって実証されています。と広い角度(典型的には> 5°) - SWAXSは、X線を弾性小さな角度(5°典型的には0.1)でのNM-範囲内不均一試料によって散乱されるテクニックです。この手法は、形状、大きさ、高分子、半順序材料、ポアサイズ、表面対体積比の特性距離の分布に関する情報を提供します。広角X線散乱(WAXSが)に基づいて0.33 nmと0.49 nmの間のサンプルのさらに小さいブラッグ間隔を解決できるのに対し、小角X線散乱(SAXS)は、1〜200nmの高分子の構造情報を供給することができます特定のシステムのセットアップおよび検出器。間隔は、ブラッグの法則から決定され、波長と入射角に依存している。

SWAXS実験では、材料は固体であってもよいまたは液体および任意の組み合わせで、同じまたは別の材料の固体、液体または気体のドメイン(いわゆる粒子)が含まれる場合があります。 SWAXSアプリケーションは、非常に広範であり、すべての種類のコロイドが含まれます:金属、複合材、セメント、油、ポリマー、プラスチック、タンパク質、食品、医薬品を。固体試料は、厚さが約5mmに制限されています。

ラボベースSWAXS機器の使用は、この論文に詳述されている。 SWAXSシステムで利用可能なソフトウェア( 例えば 、D. Svergun EMBL-ハンブルクとEasySWAXSソフトウェアによってGNOM-ATSAS 2.3パッケージ)と、実験は、与えられたサンプルについて関心の特定のパラメータを決定するために実施することができます。生体高分子実験の一例としては、選ばれたとの多数の方法により製造することができる水性水性緩衝液中の2重量%のリゾチームの分析である。試料の調製は、サンプル·セクションの準備には、以下のガイドラインに従っています。 SWAXS実験を通して、リゾチームの重要な構造的パラメータ、 例えば回転半径、分析することができます。

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1。サンプルの調製

  1. 試料容器から試料の一部を削除するために針を使用します*
  2. サンプルで(2.2ミリメートルの最大径)キャピラリーを埋めるために針を使用します。キャピラリーは下から2と3 cmの間埋めなければならない。
  3. その先端にワックスを溶融することによって毛細血管を閉じます。
  4. システムからネジを外し、真空試料ホルダーを。
  5. フューズドエンド(ワックスエンド)により毛細血管を取ると、試料ホルダーに非溶融の端を挿入します。
  6. 代わりに、システムとネジに戻しホルダーを配置します。

液体試料が毛細管内に配置する必要があり、一方(粉末試料を含む)*固体試料を直接、(必要なキャピラリなし)サンプルホルダーに置くことができます。

SWAXSマシンの起動

2。ソースコールドスタートアップ·プロシージャ

  1. 安全シャッターボタンを押してシャッターを閉じてください。
  2. 主電源を切り替えるボタンに緑を押して、 "ON"。
  3. 緊急 "シャットオフ"ボタンが延長された位置にあることを確認します。
  4. 緑色のボタンを押して主電源を切り替えます。
  5. すべてのインターロックがokあることを示し、インターロックLEDライトが緑色に点灯していることを確認します。
  6. ロードするためにタッチスクリーンを待ちます。いったんロードしており、メニューの "R6"を押します。
  7. "ON"の位置にスタンバイキーを回してください。
  8. "ON"の位置にX線キーを回してください。赤のX線光が点灯します。
  9. スタンバイレベル(30 kVと0.4ミリアンペア)を読み取るためにタッチスクリーンを待ちます。
  10. "OFF"の位置にスタンバイ安全キーをオンにします。タッチスクリーンの下部にある "スタートサイクル"ボタンを押します。
  11. 公称電力(50kV及び1 mA)を読むためにタッチスクリーンを待ちます。異なる電力レベルが望まれる場合には、タッチスクリーン上で "R4"を押して、必要な設定を入力して設定画面を表示します。

3。チラー手順

  1. 電源SWIを回し温度のコントロールパネルの "ON"の位置にTCH。制御光と、LED温度表示が点灯します。
  2. チラーの "ON"の位置に電源スイッチを切ります。
  3. 温度表示が読み取るまで待つ "OFF"にします。これは、スタンバイモードです。
  4. を押して、約4秒または温度表示されるまで、Enterボタン(リターン記号)を保持するには、実際の温度を示しています。
  5. 温度を変更するには、上矢印または下矢印を押します。それは実際の値に戻ります前に設定した値が約8秒間の温度表示に表示されます。
  6. 所望の設定値が表示されたらENTERボタンを押します。これは、その値を格納します。
  7. 実際の温度が所望の設定値に達するまで待ちます。

注:エラー"E 01"温度ディスプレイ上に表示されます場合はいつでも、チラーのシャットダウン指示に従ってください、詰め替えバスユニットタンクFILに精製水を注いでリットル、その後再びチラーの起動手順を実行します。

4。チラーのシャットダウン

  1. 約4秒間 "Enter"キーを押します。
  2. "OFF"の位置に電源スイッチを切ります。

5。真空をオンにする

  1. 真空ドアが所定の位置に固定されていることを確認。
  2. "ON"の位置に真空1と2のノブを回します。
  3. VAP5真空計が1.5ミリバール未満の真空レベルを読み取るまで待ちます。

6。検出器システムのセットアップ

  1. ガス圧を設定するには、減圧弁の主要な圧力計は少なくとも10バールであることを確認します。
  2. メインバルブを開きます。
  3. 圧力が使用圧力ゲージで8バールに達するまでゆっくり動作圧力バルブを開きます。
  4. 2主弁を開く
  5. ガス流量を調整するために、ガスコントロールパネルの垂直位置にノブを回すことにより、メイン圧バルブを開きます。
  6. 流量を調整ニードルバルブ付速度計が約8バーを読み込むまで。
  7. "ON"の位置に主電源スイッチをオンにします。 LEDライトが点灯するはずです。
  8. 高電圧を調整するには、 "ON"の位置にスイッチを回すことにより高電圧をアクティブにします。 LEDライトが点灯するはずです。
  9. 約3.5kVをゲージに到達するまで徐々に電圧制御ノブを回します。 4kVのを超えてはいけません。

7。キャリブレーション

  1. 上記の実験手順は、既知のピークのサンプルで実行されます。
  2. ASA 3.3は、5つのピークとの強度対チャネルのグラフを取得するために使用されます。
  3. メニュー→[オプション]→[入力チャネルと対応する強度に移動します。
  4. 最初の "TPF"タブ、ASA3に移動します。
  5. フィルター変更、トップは1ミリメートルニッケル(ビームフィルタ)を残しました。
  6. 位置32000(範囲28,000〜32000、28000の周りクリティカル領域)を設定→真空下5ミリバールであり、検出器がレアであることを確認していることを確認し、位置に移動1K-10Kの間で丁。
  7. 秒当たり約52カウントのため10秒間実行します。
  8. エネルギーウィンドウを、(またはしないフィルタの場合を含め、サンプルのみでエネルギーウィンドウを測定)を変更します。 10秒のために最終的な実行を設定します。
  9. 一次ビーム(例えば、チャネル233)の場所を見つける。
  10. 他の実行では、2 mmのタングステン(W、ビームストッパー)に再びフィルタ 30,000からのスタートに変更します。
  11. サンプルの他のすべてのピークの位置を探します。
  12. X線小角散乱を校正するためにImageJのマクロ·ソフトウェアを使用して- ( 図1)強度対チャネルから強度対Q(またはd間隔)への遷移を行う。
  13. WAXSを校正するためにImageJのマクロ·ソフトウェアを使用して-強度対チャネルから強度対Q(またはd間隔)への移行を行う( 図2)。

8。ソフトウェアの手順

  1. ライブデータを収集するために、ソフトウェアのASA 3.3を使用してください:ライブデータ→TPFタブ→ファイルを保存します。
  2. EasySWAX用Sは、[デバイスの設定]タブをクリックします。
  3. "a"を、ラムダ、およびdの値と同様に、重心を入力します。
  4. ポイントコリメーションを選択します。
  5. 球状​​粒子の種類を選択します(それが平らな形をした粒子のロッドであることが知られている限り)。
  6. ギニエ-Plotタブをクリックします。 IとQ 2のグラフが表示されます。
  7. ほぼ線形勾配の部分を囲むように縦線をドラッグします。
  8. 画面の下部には、R値が表示されます。これに次の検証要件があります。
  9. 検証値が1と2の間になるまで接近垂直線をドラッグし続けています。これは主観的なものです。得られたR値、または回転半径は、推定値である。

9。ソースのシャットダウン手順

  1. 安全を確認して、速いシャッターは閉じています。
  2. "ON"の位置にスタンバイキーを回してください。
  3. スタンバイ·レベルの読み取りにタッチスクリーンを待ちます。
  4. トンでプレスR5ouchscreen。
  5. 0 Aに電流を低減
  6. 0 Aに電圧を下げる
  7. "OFF"の位置にX線キーを回してください。
  8. 赤オフボタンを押して、主電源を "OFF"に切り替えます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

旋回、粒径や形状の半径、溶液構造因子、特定の内表面と細孔径、格子型で、ディメンション、および電子密度1:SAXSとWAXSは完全に次のパラメータを介して試料の構造情報を提供することができます。 SAXSとWAXSは、タンパク質ダイナミクスの研究2に適用することができます。

SWAXS実験の構造情報は、実験的に検出されたスペクトルおよびシステムの計算結果を比較することによって得られる。計算結果は、オーンスタイン·ゼルニケ(OZ)積分方程式理論(そのような分析の例は文献から見られることがあります3)などの統計力学モデルから開発合理的な有効ポテンシャルV effは (r)を使用してソフトウェアで計算した。

データ分析方法の一環として、モデル SWAXS絶対強度I(q)の どこ散乱強度I(q)は 、研究のためのソフトウェアで開発する必要があります 逆格子空間内の運動量移行の関数であり、散乱ベクトルq =4π罪(θ/ 2)/λである。qは散乱角に接続されているスカラー量、θ、放射線の波長λである。選択されたサンプルから検出器までの距離を持つ典型的なX線小角散乱実験では0.6Å-1 - qは 0.03の範囲内にある。実空間で調査領域の大きさは、r =2π/ qでqに関連しており、範囲11から2000Åの4にある。 WAXSは、他の一方で、3.3±。I(Q)より大きい間隔を解決することができますアトミック機能と原子散乱中心の位置に依存する。 SWAXS実験では、最初に測定された強度対チャネル( 図1およびqまたは間隔 d対強度に校正する必要があります

2重量%の水ベースの水性緩衝液中のリゾチームのX線小角散乱解析の例を図3に示します。得て、 図3に示すように回転半径の値は約1.44 nmの5の期待値をうまく比較しています。生体高分子へのX線小角散乱を適用する方法の例については文献から見つけられるかもしれません。6-13。水溶液中に分散させ、リポソームのWAXS分析の一例を図4に示します。増加qで減少等間隔のピークは、ラメラ構造体への水ベースの水溶液試料中のリポソームを貸す。各ラメラと、発生する散乱の低下を起こすことがあります。

図1
図1。ImageJのマクロ·ソフトウェアとSAXSのキャリブレーション。使用した試料は、d間隔48.68 Aとステアリン酸銀である。一次ビームは、チャネル367に位置しており、5主要なピーク(または試料の格子定数)が、539でそれぞれ717、896、1075、および1253のチャネルを、配置されています。

図2
図2-ImageJのマクロソフトとWAXS-Callibration。用いた試料は、パラ - ブロモ安息香酸粉末である。 6主要なピーク(または試料の格子定数)は、それぞれ130、484、555、613、657、および902チャンネルに配置されています。

図3
図3:バックグラウンド減算SAXSリゾチームの生データ(2重量%)であった。 EasySWAXSソフトウェアからギニエプロットは非常に低いqを利用することができます

図4
図4:バックグラウンド減算WAXSリポソームの生データは、水をベースとする水性溶液中に分散されたが、図4Aに示されている。リポソーム(1Dラメラ)の構造の模式図は、その親水性の頭部と疎水性の尾、そのリン脂質膜スタック、およびその電子密度関数を図4Bに示されています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SWAXSシステムの比較の手順は、実験的な分析から決定されるべき多くの変数を考慮します。解析から得られているパラメーターは、サンプルと実験のセットアップに応じて、異なる目的に使用することができます。 WAXSが原子とミクロスケールの構造( 例えば分子 ​​格子、単位格子の次元対称性)に焦点を当てているのに対してSAXSは、ナノスケールの大きさと物体の形状に関する情報を提供します。具体的には、希薄溶液中の粒子のため、X線小角散乱は旋回、粒子サイズ、形状の半径を勉強することができます。高密度試料について、X線小角散乱は溶液の構造因子を勉強しても、多孔ランダム/ 2相系では、X線小角散乱は、勉強することができます特定の内面と細孔径、及び液晶試料に対して、WAXSは格子寸法と単位セル構造を調べることがあります。しかし、SWAXSの制限は粒径や分散性の分布の広い範囲が厳しくdowngrということです実験結果をADE。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

我々は、グラーツ、オーストリアのオーストリア科学アカデミーで博士フレッドHecusのXRSのKriechbaumと生物物理学やナノシステム研究の研究所に感謝したいと思います。 LLとXWは賞号NRC-38-08から950の下で、ネリ - C賞番号DE-FG07-07ID14889、米国原子力規制委員会の下に、米国エネルギー省によって部分的にサポートされていました。 SWAXS楽器も受賞番号DE-NE0000325の下、米国エネルギー省によって部分的にサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172, (1), 128 (2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391, (7), 737 (2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27, (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357, (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27, (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
溶液中の生体高分子の小型·広角X線散乱による研究
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter