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Bioengineering

솔루션의 생물 고분자의 작은 및 와이드 앵글 X-레이 산란 연구

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

작고 다양한 각도 X-선 산란 (SWAXS) 절차의 데모는 생물 고분자의 연구 수단이되고있다. 특정 각도 방법과 준비 계측 및 절차의 사용을 통해, SWAXS의 실험 데이터는 고분자의 원자 및 나노 규모 특성을 표시합니다.

Abstract

본 논문에서는 고분자의 소형 및 와이드 앵글 X-선 산란 (SWAXS) 분석 실험을 통해 입증된다. 넓은 각도 (일반적으로> 5 °) - SWAXS는 X-선을 탄 성적으로 작은 각도 (5 ° 일반적으로 0.1)에서 나노 미터 범위의 inhomogeneous 샘플에 의해 분산되어 기술입니다. 이 기술은 모양, 크기, 고분자, 부분적으로 주문 자료, 기공 크기 및 표면 - 투 - 볼륨 비율의 특성 거리의 분포에 대한 정보를 제공합니다. 와이드 앵글 X-선 산란 (WAXS)가에 따라 0.33 나노 미터와 0.49 나노 미터 사이의 샘플도 작은 브래그 간격을 해결할 수 있습니다 반면, 작은 각도 X-선 산란 (SAXS)는, 1, 200 nm의 사이에 고분자의 구조 정보를 제공 할 수 있습니다 특정 시스템 설정 및 검출기. 간격은 브래그의 법칙에서 결정하고 파장과 사건 각도에 따라 달라입니다.

SWAXS 실험에서, 자료는 고체 수 있습니다또는 액체와 조합에서 동일한 또는 다른 재료의 고체, 액체 또는 기체 도메인 (소위 입자)를 포함 할 수 있습니다. SWAXS 응용 프로그램은 매우 광범위하고 모든 유형의 colloids은 다음과 같습니다 금속, 복합 재료, 시멘트, 석유, 폴리머, 플라스틱, 단백질, 식품 및 제약합니다. 고체 시료를 들어, 두께는 약 5mm로 제한됩니다.

실험실 기반의 SWAXS 장비의 사용이 논문에 자세히 설명되어 있습니다. SWAXS 시스템에 사용할 수있는 소프트웨어 (예를 들어, D. Svergun EMBL - 함부르크 (Hamburg)와 EasySWAXS 소프트웨어를 사용하여 GNOM - ATSAS 2.3 패키지)를 통해 실험은 주어진 샘플에 대한 관심의 특정 매개 변수를 결정하기 위해 실시 할 수 있습니다. 생물 macromolecule 실험 중 하나 예 선택하고 다양한 방법으로 준비 할 수있는 물을 기반 수성 버퍼 2 중량 %의 라이소자임의 분석이다. 샘플의 준비는 샘플 섹션의 준비에 아래의 지침을 따릅니다. SWAXS 실험을 통해,라이소자임의 중요한 구조 매개 변수는 단면 2 차 반경을 예를 들어, 분석 할 수 있습니다.

Protocol

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1. 샘플의 작성

  1. 샘플 컨테이너에서 샘플의 일부를 제거하는 바늘을 사용합니다. *
  2. 모세관을 채우기 위해 바늘을 사용 (2.2 mm 최대 직경) 샘플. 모세는 바닥에서 2 3cm 사이에 작성해야합니다.
  3. 그 끝에 녹는 왁스로 모세관을 닫습니다.
  4. 나사가 빠지다 시스템에서 진공 샘플 홀더를.
  5. 융합 끝 (왁스 끝)에 의해 모세관를 타고 샘플 홀더에 해제 - 융합 끝을 삽입합니다.
  6. 장소에 시스템 및 나사에 다시 홀더를 배치합니다.

액체 샘플이 모세관에 삽입해야합니다 반면, * 고체 시료 (분말 샘플 포함) 직접 샘플 홀더 (NO 모세관 필요)에 배치 할 수 있습니다.

시작 - 업 SWAXS 기계의

2. 소스 냉간 시동 절차

  1. 안전 셔터 버튼을 눌러 셔터를 닫습니다.
  2. 주 전원 스위치버튼을 녹색을 눌러 "ON".
  3. 긴급 "시스템 종료 - 오프 '버튼을 확장 위치에 있는지 확인합니다.
  4. 녹색 버튼을 눌러에 주 전원을 전환합니다.
  5. 연동 LED의 빛은 모든 연동 괜찮 니 나타내는 녹색 확인합니다.
  6. 로드 터치 스크린이 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 일단로드, 메뉴의 "R6"를 누르십시오.
  7. "ON"위치로 대기 모드 키를 설정합니다.
  8. "ON"위치로 X-레이 키를 설정합니다. 빨간색 X-선 라이트가 점등합니다.
  9. 대기 수준 (30 KV와 0.4 mA)을 읽는 터치 스크린이 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
  10. "OFF"위치에 대기 안전 키를 설정합니다. 터치 스크린 하단에있는 "시작주기"버튼을 누르십시오.
  11. 정격 출력 (50 KV와 1mA)를 읽어 터치 스크린이 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 다른 전원 수준이 필요하다면, 터치 스크린에 'R4'를 누르고 원하는 설정을 입력하여 구성 화면을 입력합니다.

3. 냉각기 절차

  1. 전원을 켜 swi온도 제어 패널의 "ON"위치로 tch. 제어 빛과 LED 온도 표시가 점등됩니다.
  2. 냉각기에있는 "ON"위치로 전원 스위치를 켜십시오.
  3. 온도 디스플레이가 읽 때까지 기다리십시오 "OFF." 이 대기 모드입니다.
  4. 누르면 약 4 초 또는 온도 표시 될 때까지 ENTER 버튼 (반환 기호)를 개최는 실제 온도를 나타냅니다.
  5. 온도를 변경하려면 위 또는 아래 화살표를 누르십시오. 그것이 실제 값으로 돌아갑니다 전에 설정 값은 약 8 초 동안 온도 디스플레이에 표시됩니다.
  6. 원하는 설정 값이 표시되면 ENTER 버튼을 누릅니다. 이것은 값을 저장합니다.
  7. 실제 온도가 원하는 설정 값을 도달 할 때까지 기다리십시오.

참고 : 언제든지 오류 "E 01"온도 디스플레이에 표시되면, 탱크 fil에 정화 물을 붓는하여 냉각 시스템 종료 방법, 충전 목욕 단위를 따르십시오저는 다음 다시 냉각기의 시작 절차를 수행합니다.

4. 냉각기의 종료

  1. 약 4 초에 "를 입력"키를 누릅니다.
  2. "OFF"위치로 전원 스위치를 켜십시오.

5. 진공 켜기

  1. 진공 문이 곳에서 고정되어 있는지 확인합니다.
  2. "ON"위치로 진공 1, 2 노브를 켜십시오.
  3. VAP5 진공 게이지 1.5 mbar보다 진공 레벨 이하 읽습니다 때까지 기다리십시오.

6. 감지기 시스템 설치

  1. 가스 압력을 설정하려면 확인 감소 밸브의 주요 압력 게이지는 최소 10 줄입니다.
  2. 메인 밸브를 엽니 다.
  3. 압력이 운영 압력 게이지 8 줄을 도달 할 때까지 천천히 작동 압력 밸브를 엽니 다.
  4. 두 번째 메인 밸브를 엽니 다
  5. 가스의 흐름을 조정하려면 가스 제어 패널의 수직 위치에 노브를 돌려 메인 압력 밸브를 엽니 다.
  6. 흐름을 조정니들 밸브와 속도 게이지가 약 8 줄을 읽습니다 때까지.
  7. "ON"위치로 주 전원 스위치를 켜십시오. LED 빛은 점등합니다.
  8. 높은 전압을 조정하려면 "ON"위치로 스위치를 설정하여 높은 전압을 활성화합니다. LED 빛은 점등합니다.
  9. 약 3.5kV이 게이지에 도달 할 때까지 천천히 전압 제어 노브를 켜십시오. 4kV를 초과하지 마십시오.

7. 구경 측정

  1. 위의 실험 단계는 알려진 봉우리의 샘플로 수행됩니다.
  2. ASA 3.3은 5 봉우리와 강도 대 채널의 그래프를 얻을하는 데 사용됩니다.
  3. 메뉴로 이동 → 옵션 → 채널과 해당 농도를 입력합니다.
  4. 첫번째 "TPF '탭을 ASA3로 이동합니다.
  5. 필터 변경, 상단 1mm 니켈을 (빔 필터) 떠났다.
  6. → 위치로 이동 검출기는 정말이에요 있는지 확인해야 진공은 아래 5 mbar인지 확인 위치 32000을 (32000에 이르는 28,000, 28,000 주위에 중요한 지역) 설정1,000 - 10,000 사이 땡.
  7. 초 당 약 52 카운트에 대한 10 초에 실행합니다.
  8. 에너지 창을 (또는하지 필터 케이스 포함 만 샘플로 에너지 창을 측정) 변경합니다. 10 초에 대한 최종 실행을 설정합니다.
  9. 주 빔 (예를 들어 채널 233)의 위치를​​ 찾습니다.
  10. 다른 실행를 들어, 2mm 텅스텐 (W, 빔 스토퍼)로 다시 필터링하고 30,000부터 시작을 변경할 수 있습니다.
  11. 샘플 다른 모든 봉우리의 위치를​​ 찾습니다.
  12. SAXS을 보정 ImageJ - 매크로 소프트웨어를 사용하여 - (그림 1) 강도 대 채널에서 강도 대 Q (또는 D 간격)로 전환하는.
  13. WAXS을 보정 ImageJ - 매크로 소프트웨어를 사용 - 강도 대 채널에서 강도 대 Q (또는 D 간격)로 전환하기 (그림 2).

8. 소프트웨어 절차

  1. 라이브 데이터를 수집하기 위해, 소프트웨어에게 ASA 3.3 사용 : 라이브 데이터 → TPF 탭 → 파일을 저장합니다.
  2. EasySWAX에 대한S는 장치 설정 탭을 클릭합니다.
  3. "A", 람다, 및 D 값뿐만 아니라 무게 중심을 입력합니다.
  4. 포인트 시준을 선택합니다.
  5. 구상 입자 유형을 선택합니다 (이것은 평면 모양의 입자의로드로 알려져 있지 않는 한).
  6. Guinier - 플롯 탭을 클릭합니다. I 대 Q이 그래프가 표시됩니다.
  7. 약 선형 기울기의 한 부분을 둘러싸고있는 수직 라인을 끕니다.
  8. 화면의 하단에서 R 값이 표시됩니다. 이 옆에 유효성 검사 요구 사항이 있습니다.
  9. 유효성 검사 값이 1과 2 사이에 때까지 서로 가깝게 수직 라인을 드래그하고 있습니다. 이 주관적입니다. 획득 R 값, 단면 2 차 반경, 추정치입니다.

9. 소스 종료 절차

  1. 안전을 확인하고 빠른 셔터은 실행 종료와 함께 해제된다.
  2. "ON"위치로 대기 모드 키를 설정합니다.
  3. 대기 수준을 읽을 터치 스크린 기다립니다.
  4. t에 보도 R5ouchscreen.
  5. 0 A.에 전류를 감소
  6. 0 A.에 전압을 감소
  7. "OFF"위치에 X-레이 키를 설정합니다.
  8. 빨간색 해제 버튼을 눌러 주 전원 "OFF"를 전환합니다.

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Representative Results

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선전, 입자의 크기와 모양, 솔루션 구조 요소, 특정 내부 표면 및 기공 크기, 격자 유형 및 크기, 그리고 전자 밀도 1의 반경 : SAXS와 WAXS 교수는 다음 매개 변수를 통해 샘플의 구조 정보를 제공 할 수 있습니다. SAXS 및 WAXS 또한 단백질 역학 (2)의 연구에 적용 할 수 있습니다.

SWAXS 실험의 구조 정보는 실험적으로 발견 스펙트럼과 시스템의 계산 결과를 비교하여 얻어진다. 계산 결과는 같은 Ornstein-Zernike (OZ) 적분 방정식 이론 (예 : 분석의 예를 참조에서 볼 수 있습니다. 3)과 같은 통계 역학 모델에서 개발 한 합리적인 효과가 잠재적 인 V EFF (R)과 소프트웨어에서 계산 된 .

데이터 분석 방법, 모델의 일부로서 SWAXS 절대 강도 I (Q)에 대한 연구를위한 소프트웨어 개발해야합니다 위치에 분산 강도, I (Q), 상호 공간에 운동량 전달의 기능이며, 산란 벡터 Q는 = 4π 죄 (θ / 2) / λ. Q는 θ 산란 각도, 그리고 방사선, λ의 파장에 연결되어 스칼라 양이다. Q는 0.03의 범위에 있습니다 - 0.6 Å -1을 선택한 샘플 - 투 - 검출기 거리가있는 전형적인 SAXS 실험 인치 실제 공간에서 조사 지역의 크기는 R = 2π / Q에서 Q에 관한, 그리고 범위 11-2000 4에 자리 잡고 있습니다. 있습니다 WAXS는 반면에, Å. I (Q)는 원자 기능과 원자 분산 센터의 위치에 따라 달라집니다 3.3보다 큰 간격을 해결할 수 있습니다. SWAXS 실험에서 처음 측정 된 강도 대 채널 (그림 1과 Q 또는 간격 D 대 강도로 조정해야

2 중량 %의 물을 기반 수성 버퍼에있는 라이소자임의 SAXS 분석의 예는 그림 3에 표시됩니다. 취득 및 그림 3에 표시된 단면 2 차 반경의 값은 약 1.44 nm의 (5)의 기대 값에 잘 비교합니다. 생물 고분자에 SAXS를 적용하는 방법에 대한 자세한 예는 심판이 판결에서 발견 할 수 있습니다. 6-13는. 리포좀의 WAXS 분석의 예는 그림 4에 표시되어 수용액에 분산. 증가 Q를 감소 동등하게 이격 된 봉우리는 층상 구조로 물 기반의 수용액 샘플의 리포좀을 대여. 각 lamellae로 발생 산란 감소가 있습니다.

그림 1
그림 1. ImageJ - 매크로 소프트웨어와 SAXS 보정. 사용 예제는 D 간격 48.68 Å은은 스테아르 산입니다. 기본 빔은 채널 367에 위치하고 있으며, 5 개의 주요 봉우리 (또는 샘플의 격자 매개 변수), 539에서 각각 717, 896, 1​​,075 및 1,253 채널을 자리 잡고 있습니다.

그림 2
그림 2. ImageJ - 매크로 소프트웨어와 WAXS-Callibration. 사용 예제는 파라 - 브로 모 Benzoic 산 분말입니다. 6 개 주요 봉우리 (또는 샘플의 격자 매개 변수)는 각각 130, 484, 555, 613, 657 및 902 채널,에 위치하고 있습니다.

그림 3
그림 3. 배경 - 공제 SAXS 라이소자임의 원시 - 데이터 (2 중량 %). EasySWAXS 소프트웨어의 Guinier - 줄거리는 매우 낮은 Q를 활용할 수

그림 4
그림 4. 배경 - 공제 WAXS 리포좀의 원시 - 데이터가 물을 따라 수용액에 분산은 그림 4A에 표시됩니다. 리포좀의 구조의 개략적 인 다이어그램 (1D 층상)의 친수성 머리와 소수성 꼬리의 인지질 막 스택, 그리고 전자 밀도 함수는 그림 4B에 표시됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

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SWAXS 시스템의 비교 절차는 실험 분석에서 결정되는 수많은 변수를 할 수 있습니다. 분석 달성하는 매개 변수 샘플 및 실험 설정에 따라 다양한 용도로 사용할 수 있습니다. WAXS는 원자 및 마이크로 규모의 구조 (예 : 분자 격자, 단위 셀 치수 대칭)에 초점을 맞추고 반면 SAXS는 나노 규모의 크기와 물체의 모양에 대한 정보를 제공합니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 희석 솔루션의 입자를 들어, SAXS는 나선, 입자 크기, 모양의 반지름을 공부할 수, 고밀도 샘플에 대해, SAXS은 솔루션의 구조 요소를 공부 수 있으며, 다공성 무작위 / 2 단계 시스템을위한, SAXS 공부 할 수 있습니다 특정 내부 표면 및 기공 크기 및 액체 결정 샘플에 대해 WAXS는 격자 크기 및 단위 세포 구조를 연구 할 수 있습니다. 그러나, SWAXS의 한계는 입자 크기 나 polydispersity 배포의 다양한 범위가 심각하게 downgr 것입니다실험 결과를 ADE.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 그라츠 (Graz), 오스트리아 과학 아카데미 오스트리아에서 박사 만프레드 Hecus의 XRS의 Kriechbaum 및 생물 물리학 및 Nanosystems 연구 연구소 감사드립니다. LL 및 XW는 수상 번호 NRC-38-08-950 아래 네리-C 상 번호 DE-FG07-07ID14889, 미국 원자력 규제위원회에서, 에너지 미국학과에 의해 부분적으로 지원되었다. SWAXS기구는 수상 번호 DE-NE0000325 아래, 에너지의 미국학과에 의해 부분적으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

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References

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Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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