Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Små och Wide Angle X-ray scattering Studier av biologiska makromolekyler i lösning

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

Demonstrationen av de små och vidvinkel röntgenspridning (SWAXS) förfarande har blivit avgörande för studier av biologiska makromolekyler. Genom användning av instrumentering och förfaranden för specifik vinkel metoder och förberedelse, visar experimentella data från SWAXS atom-och nanonivå karakterisering av makromolekyler.

Abstract

I detta dokument är liten och vidvinkel röntgenspridning (SWAXS) analys av makromolekyler visas genom experiment. SWAXS är en teknik där röntgenstrålar elastiskt spritts av en inhomogen prov i nm-området vid små vinklar (typiskt 0,1 till 5 °) och breda vinklar (typiskt> 5 °). Denna teknik ger information om form, storlek och fördelning av makromolekyler, karakteristiska avstånd av delvis ordnade material, porstorlekar och surface-to-volymförhållandet. Liten vinkel X-ray scattering (SAXS) kan leverera strukturell information av makromolekyler mellan 1 och 200 nm, medan vidvinkel X-ray scattering (WAXS) kan lösa ännu mindre Bragg avståndet av prover mellan 0,33 nm och 0,49 nm baserade på specifikt system installation och detektor. Avståndet bestäms från Braggs lag och är beroende på våglängden och infallsvinkeln.

I ett SWAXS experiment kan materialen vara fastaeller flytande och kan innehålla fasta, flytande eller gasformiga domäner (så kallade partiklar) av samma eller annat material i någon kombination. SWAXS applikationer är mycket bred och omfattar kolloider av alla typer: metaller, kompositer, cement, olja, polymerer, plaster, proteiner, livsmedel och läkemedel. För fasta prover, är tjockleken begränsad till ungefär 5 mm.

Användning av ett labb-baserade SWAXS instrument beskrivs i detta dokument. Med tillgänglig programvara (t.ex. GNOM-ATSAS 2,3 paket av D. Svergun EMBL-Hamburg och EasySWAXS programvara) för SWAXS systemet kan ett experiment utföras för att bestämma vissa parametrar av intresse för givet prov. Ett exempel på en biologisk makromolekyl experiment är analysen av 2 vikt-% lysozym i en vatten-baserad vattenhaltig buffert som kan väljas och framställas genom ett stort antal metoder. Beredningen av provet följer riktlinjerna nedan i Provberedning sektionen. Genom SWAXS experiment,viktiga strukturella parametrar för lysozym, t.ex. tröghetsradie, kan analyseras.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Beredning av provet

  1. Använd en nål för att avlägsna en del av provet från provbehållaren. *
  2. Använd nålen att fylla kapillären (maximal diameter på 2,2 mm) med provet. Kapillären måste fyllas mellan 2 och 3 cm från botten.
  3. Stäng kapillären genom smältning vax på sin spets.
  4. Skruva loss hållaren vakuum prov från systemet.
  5. Ta kapillären i smält änden (vax slutet) och sätt i icke-kondenserade änden i provhållaren.
  6. Placera hållaren tillbaka in i systemet och skruva fast.

* Fasta prover (inbegripet pulver prover) kan direkt placeras i provhållaren (ingen kapillär nödvändigt), medan flytande prov skall placeras i en kapillär.

Uppstart av den SWAXS Machine

2. Källa Kall Idrifttagningsförlopp

  1. Stäng luckan genom att trycka på knappen säkerhet slutaren.
  2. Slå av huvudströmbrytaren"ON" genom att trycka på den gröna på knappen.
  3. Verifiera Emergency "Shut-Off"-knappen är i utdraget läge.
  4. Slå av huvudströmbrytaren på genom att trycka på den gröna knappen.
  5. Verifiera interlock LED-ljus lyser grönt, vilket visar alla förreglingar är ok.
  6. Vänta på pekskärmen för att ladda. När den har laddats, tryck på "R6" på menyn.
  7. Vrid Standby nyckeln till läge "ON".
  8. Vrid röntgen Nyckeln till läge "ON". Den röda röntgen ljus ska tändas.
  9. Vänta på pekskärmen för att läsa standby nivåer (30 kV och 0,4 mA).
  10. Vrid Standby säkerhetsnyckeln på "OFF". Tryck på "Start Cycle"-knappen på undersidan av skärmen.
  11. Vänta på pekskärmen för att läsa märkeffekt (50 kV och 1 mA). Om en annan effektnivå önskas, ange konfigurationen skärmen genom att trycka "R4" på pekskärmen och ange önskade inställningar.

3. Chiller Procedur

  1. Slå på strömmen switch till "ON" på temperatur kontrollpanelen. En kontroll ljus och LED temperaturdisplayen lyser.
  2. Vrid strömbrytaren till läge "ON" på kylaggregatet.
  3. Vänta tills temperaturen displayen visar "OFF". Detta är standby-läge.
  4. Tryck och håll på Enter-knappen (retur symbol) i ca 4 sekunder eller tills temperaturen displayen visar en aktuell temperatur.
  5. För att ändra temperaturen genom att trycka på upp-eller nedpilarna. Det inställda värdet visas på temperaturdisplayen för cirka 8 sekunder innan den återgår till det verkliga värdet.
  6. Tryck på Enter-knappen när önskad inställda värdet visas. Detta kommer att spara detta värde.
  7. Vänta tills den faktiska temperaturen når det önskade inställda värdet.

OBS: Om du någon gång felet "E 01" dyker upp på temperaturdisplayen, följ instruktionerna Chiller avstängning fylla badet enheten genom att hälla renat vatten till tanken fill, och utför sedan proceduren kylaggregatets start igen.

4. Avstängning av Chiller

  1. Tryck på "enter" för ca 4 sek.
  2. Vrid strömbrytaren till läge "OFF".

5. Slå på vakuum

  1. Säkerställ vakuum dörren sitter på plats.
  2. Vrid Vakuum 1 och 2 rattar till "ON" läge.
  3. Vänta tills VAP5 vakuummätaren läser en vakuumnivå mindre än 1,5 mbar.

6. Detektor Systeminställningar

  1. För att ställa in gastrycket, kontrollera Main Manometer av reduceringsventilen är minst 10 bar.
  2. Öppna huvudventilen.
  3. Sakta öppna ventilen Arbetstryck tills trycket når 8 bar vid drift manometer.
  4. Öppna den andra Huvudventil
  5. För att justera gasflödet, öppna Main Pressure ventilen genom att vrida vredet till vertikalt läge på gasen kontrollpanelen.
  6. Justera flödettakt med nålventilen tills mätaren läser ungefär 8 bar.
  7. Vrid huvudströmbrytaren till läge "ON". LED ljus ska tändas.
  8. För att justera den höga spänningen, aktivera den höga spänningen genom att vrida omkopplaren till läge "ON". LED ljus ska tändas.
  9. Vrid långsamt spänningen manöverratten tills ungefär 3.5kV nås på mätaren. ÖVERSKRID INTE 4kV.

7. Kalibrering

  1. De experimentella stegen ovan utförs med ett prov av kända toppar.
  2. ASA 3,3 används för att erhålla diagram av intensitet kontra kanal med 5 toppar.
  3. Gå till Meny → Val → Ange kanaler och motsvarande intensitet.
  4. Gå till ASA3, "TPF"-fliken först.
  5. Byt filter, vänster topp 1 mm Nickel (balk-filter).
  6. Ställ ställning 32.000 (intervall 28.000 till 32.000, kritisk region runt 28.000) → gå till läge, se vakuum är lägre än 5 mbar, se till att detektorn är reading mellan 1k-10K.
  7. Kör i 10 sekunder för cirka 52 impulser per sekund.
  8. Ändra energi fönster, (eller mäta den energi fönstret med provet enbart, exklusive filter fallet). Ställ in sista körning för 10 sek.
  9. Hitta platsen för den primära strålen (kanal 233 till exempel).
  10. För andra körningar, ändra filtret igen till 2 mm volfram (W, balk propp) och börja om från 30.000.
  11. Hitta platsen för alla andra toppar av proverna.
  12. Använd ImageJ-makro-programvara för att kalibrera SAXS - gör övergångar från intensitet vs kanal till intensiteten vs q (eller d avstånd) (Figur 1).
  13. Använd ImageJ-makro-programvara för att kalibrera WAXS - gör övergångar från intensitet vs kanal till intensiteten vs q (eller d avstånd) (Figur 2).

8. Programvara Förfarande

  1. Använd Software ASA 3,3, för att samla in realtidsdata: Live Data → TPF fliken → Spara filen.
  2. För EasySWAXS, klicka på fliken Enhetsinställningar.
  3. Ange "en", lambda, och d-värden, liksom tyngdpunkten.
  4. Välj Point Kollimation.
  5. Välj globulära partikeltyp (såvida det är en känd för att vara en stav av platt formad partikel).
  6. Klicka på Guinier-Plot fliken. En I vs q 2 grafen visas.
  7. Dra de vertikala linjerna att omge en del av ungefär linjärt lutning.
  8. Längst ned på skärmen, kommer ett R-värde visas. Bredvid detta finns ett validering krav.
  9. Fortsätt att dra vertikala linjer närmare varandra tills validering värdet är mellan 1 och 2. Det är subjektivt. R-värdet, eller tröghetsradie, erhålls är en uppskattning.

9. Källa Avstängningsrutin

  1. Verifiera säkerhet och snabba luckor är stängda.
  2. Vrid Standby nyckeln till läge "ON".
  3. Vänta på pekskärmen för att läsa standby nivåer.
  4. Tryck R5 på touchscreen.
  5. Minska strömmen till 0 A.
  6. Minska spänningen till 0 A.
  7. Vrid röntgen nyckeln till läge "OFF".
  8. Slå på huvudströmbrytaren "OFF" genom att trycka på den röda OFF-knappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SAXS och WAXS helt kan ge strukturell information om provet genom följande parametrar: tröghetsradie, partikelstorlek och form, lösning struktur faktor, specifik inneryta och porstorlek, gitter typ och dimension, och elektrontätheten 1. SAXS och WAXS kan också användas för att studera protein dynamik 2.

Den strukturella informationen av SWAXS experiment erhålls genom att jämföra den experimentellt detekterade spektra och beräkningsresultat i systemet. De beräkningsresultat beräknades i programmet med en rimlig effektiv potential V eff (r) utvecklats från statistisk mekanik modeller, såsom Ornstein-Zernikes (OZ) integralekvation teori (ett exempel på en sådan analys kan ses från ref. 3) .

Som en del av dataanalysen metoder, modeller för SWAXS absoluta intensiteten I (q) kommer att behöva utvecklas i programvaran för studien, där spridningsintensiteten, I (k), är en funktion av impulsöverföringsfenomen i det reciproka rummet, spridningen vektorn q = 4π sin (θ / 2) / λ. q är en skalär kvantitet som är ansluten till spridningsvinkeln, θ, och våglängden av strålningen, λ. q ligger i intervallet 0,03 till 0,6 Å -1 i ett typiskt SAXS experimentera med en utvald grupp-till-detektor avstånd. Storleken på den region undersökts i det reella rummet är relaterad till q med r = 2π / q, och ligger i intervallet 11-2000 Å 4. WAXS, å andra sidan, kan lösa avstånd större än 3,3 Å.. I (q) beror på de atomära funktioner och ställning de atomära spridningscentra. I SWAXS experimentet först uppmätta intensiteten vs kanal måste kalibreras till intensiteten vs q eller avstånd d (fig 1 och

Ett exempel på SAXS analysen av lysozym i 2 vikt% vattenbaserad vattenhaltig buffert visas i figur 3. Värdet för tröghetsradie erhållits och visas i Figur 3 jämför fint till det förväntade värdet av ca 1,44 nm 5. Fler exempel på hur man ansöker SAXS för biologiska makromolekyler kan hittas från ref. 6-13. Ett exempel på WAXS analysen av liposomen dispergerade i vattenhaltig lösning visas i figur 4. De jämnt fördelade toppar minskar med ökande Q ger liposomen i vattenbaserade vattenlösningen prov till en lamellär struktur. Med varje lameller, sker en minskning i spridningsmediet som kommer att inträffa.

Figur 1
Figur 1. Den SAXS Kalibrering med ImageJ-makro-programvara. Provet som används är silver stearat med d avstånd 48,68 Å.. Den primära strålen ligger vid kanalen 367 och de fem huvudtoppar (eller gitterparametrar av provet) är belägna vid 539, 717, 896, 1075, och 1253 kanaler, respektive.

Figur 2
Figur 2. Den WAXS-Callibration med ImageJ-makro-programvara. Provet som används är Para-brom bensoesyra pulver. De sex större toppar (eller gitterparametrar av provet) är belägna vid 130, 484, 555, 613, 657, och 902 kanaler, respektive.

Figur 3
Figur 3. Bakgrund-korrigerad SAXS rå-data av lysozym (2 vikt%). Det Guinier-plot från EasySWAXS programvara kan utnyttja den mycket låga q

Figur 4
Figur 4. Bakgrund-subtraherade WAXS rå-data av liposom dispergerade i en vatten baserad vattenhaltig lösning visas i figur 4A. De schematiska diagram över strukturen av liposomer (1D lamellär), dess hydrofila huvud och hydrofob svans, dess fosfolipid membran stack och dess elektrontäthet funktion visas i figur 4B. Klicka här för att se större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den jämförande förfarande för SWAXS systemet tillåter för många variabler som skall fastställas av experimentell analys. De parametrar som uppnås från analysen kan användas för olika ändamål beroende på provet och experimentuppställning. SAXS ger information om nanonivå storlek och form på objektet, medan WAXS fokuserar på atom-och mikroskala struktur (t.ex. molekylär gitter, enhetscelldimension symmetri). Mer specifikt, för partiklar i utspädda lösningar, kan SAXS studera tröghetsradie, partikelstorlek och form, för högdensitetsområden prover, kan SAXS studera strukturen faktorn för lösningen, för slumpmässiga porösa / 2 fas-system, kan SAXS studera specifik inneryta och porstorlek, och för flytande kristallina prover, kan WAXS studera lattice dimensioner och enhetscellen struktur. Emellertid är en begränsning av SWAXS att ett brett spektrum av fördelning av partikelstorlekar eller polydispersitet allvarligt kommer downgrAde de experimentella resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr Manfred Kriechbaum av Hecus XRS och Institutet för Biofysik och nanosystem Forskning vid österrikiska vetenskapsakademin i Graz, Österrike. LL och XW stöddes delvis av US Department of Energy, enligt NERI-C Award nr DE-FG07-07ID14889 och US Nuclear Regulatory Commission, enligt Award nr NRC-38-08-950. Den SWAXS instrumentet också delvis stöd i US Department of Energy, enligt Award nr DE-NE0000325.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172, (1), 128 (2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391, (7), 737 (2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27, (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357, (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27, (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
Små och Wide Angle X-ray scattering Studier av biologiska makromolekyler i lösning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter