Summary
Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados tumorais ou com proteínas purificadas.
Abstract
Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular. O substrato (farol) é composto de um deoxyoligonucleotide contendo uma lesão de uma única base com um 6-Carboxifluoresceína (6-FAM) porção conjugada com o extremo 5 'e uma porção DABCYL conjugada com a extremidade 3' do oligonucleótido. O RIC farol molecular é de 43 bases de comprimento ea sequência foi concebida para promover a formação de uma estrutura de haste loop-com 13 nucleótidos no loop e 15 pares de bases no 1,2-tronco. Quando dobrada nesta configuração da porção 6-FAM é extinta por DABCYL de uma maneira não fluorescente via Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 3,4. A lesão é posicionada de tal modo que a remoção da lesão seguinte base e cisão vertente o oligonucleótido de base restante 5 contendo a porção 6-FAM é libertado a partir da haste. Solte umadescolamento nd do (DABCYL) Quencher resulta em um aumento de fluorescência que é proporcional ao nível de reparo do DNA. Ao coletar várias leituras dos valores de fluorescência, em tempo real avaliação da atividade da RIC é possível. O uso de padrão quantitativo PCR em tempo real instrumentos permite a análise simultânea de várias amostras. O desenho destes balizas BER moleculares, com uma lesão de uma única base, é passível de análises cinéticos, quantificação BER e validação inibidor e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecidos e os lisados de células de tumor ou com proteínas purificadas. A análise da actividade BER em lisados de tumor ou tecido aspira usando estas balizas molecular pode ser aplicável a medições de biomarcadores funcionais. Além disso, a análise da actividade BER com proteínas purificadas usando este ensaio quantitativo fornece uma rápida, o método de alto rendimento para a descoberta e validação de inibidores de BER.
Protocol
1. Projeto Beacon Molecular
1,1 Projetando e encomendar o seu farol molecular
O design do seu farol molecular deve considerar o seguinte:
- Temos bons resultados com oligonucleotídeos 43 mer DNA. O conteúdo de GC deve ser> de 32%. Excluir uma base G na extremidade 5 '.
- Pedido 6-FAM (6-Carboxifluoresceína) conjugação na extremidade 5 'e DABCYL como um 3' modificação.
- A posição da lesão deve estar na base # 6 a partir da extremidade 5 '.
- O comprimento da haste ou duplex hairpin deve ser um mínimo de 15 pb.
- O comprimento da laçada recomendada é de 13 bases.
- A estrutura geral da baliza é como mostrado na Figura 1.
- Uma vez que a seqüência e lesão tipo é decidido, o oligonucleotídeo pode ser encomendado a partir de a maioria das empresas de oligonucleotídeos. Nós ordenamos nossos oligonucleotídeos de IDT e solicitar que os oligonucleotídeos são purificada por HPLC e provided como um pó ou em um formato seco.
1,2 Recozimento seu farol molecular
- Dissolve-se oligonucleótidos de DNA liofilizados em Oligo tampão de diluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 0,1 mM) para dar uma solução stock concentrada Molecular Beacon de 40 uM.
- Preparar uma solução de baliza 200nM Molecular trabalhando a partir do 40 mM de solução stock Molecular Beacon utilizando o tampão de reacção BER (ver abaixo). Adicione a 200 nM solução Beacon Molecular trabalhando para um tubo estéril mL preto 1.5.
- Incubar o tubo contendo a 200 nM solução farol molecular trabalhando num copo grande de água a ferver durante 3 minutos.
- Após 3 minutos, retirar o copo da fonte de calor e incubar as balizas molecular na água durante a noite para promover recozimento. Use isolador de calor materiais tanto sobre e sob o copo para retardar o processo de arrefecimento.
- Beacons alíquotas em estéreis, preto tubos de 1,5 ml, 100 ul de cada tubo.
- Armazenar a -30 ° C.
1.3 Análise de Qualidade de seu farol molecular
- Realizar uma análise da curva de fusão para confirmar que as balizas BER moleculares não fluorescência até aquecida, para determinar a temperatura de fusão óptima e para confirmar que cada baliza irá fluorescência quando aquecido.
- Para cada baliza adicionar o volume da solução indicada Beacon 200 nM Molecular trabalho e tampão de reacção BER, tal como indicado na Tabela 1, a 6 poços de uma rápida placa de 96 poços óptico (Applied Biosystems, Cat # 4.346.906).
- Use um tempo real instrumento de PCR tais como o sistema StepOnePlus (Applied Biosystems) ou semelhante para monitorar FAM-corante de excitação durante a análise da curva de fusão.
- Programa seu tempo real instrumento de PCR (sistema StepOnePlus) para monitorar FAM excitação do corante como uma função do aumento da temperatura em pequenos incrementos para análise da curva de fusão. O sistema de StepOnePlus é programado para medir FAM fluorescemnce e rampa entre 25 ° C a 95 ° C em 0,5 intervalos ° C. Uma curva de fusão típico é mostrado na Figura 2.
- Fluorescência de fundo pouca ou nenhuma deve ser visível a temperaturas inferiores a 50 ° C. Verifique se há um aumento uniforme e íngreme na fluorescência, indicativos das balizas de pura qualidade e alta. Os valores de Tm de cerca de 60 ° C a 80 ° C são favoráveis e deve ser igual para todas as diluições.
- Determinar T max, a temperatura a máximas de fluorescência [FL (max)] valores, a partir desta análise. A proporcionalidade dos valores de fluorescência em T m ou T max para a entrada de farol (a concentração) deve ser linear. O valor de fluorescência em T max, Fl (max), deve exceder os valores de fundo, a 37 ° C pelo menos 5 vezes.
2. Preparação Lysate Nuclear
Base de dados de 2,1 Excisão Repair reação buffer de 5 preparação
- Adicionar todos os componentes listadosna Tabela 2 e trazer o volume do tampão para 900 mL com DDQ 2 O.
- Ajustar o pH a 7,8 usando hidróxido de potássio 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
- Traga o volume do tampão para 1000 mL com DDQ 2 O.
- Filtrar o buffer usando 0,22 uM de filtro, Nalgene de 1 L de filtro (cat # 167-0020).
- Adicionar Ditiotreitol (DTT), imediatamente antes de utilizar o tampão de reacção BER.
2,2 cultura de células e isolamento das células
- Sugere-se a células de cultura confluente até 90-100%. Isolar as células a partir de 4-6 pratos (150 mm) para se obter lisado nuclear suficiente para um conjunto completo de análise (aproximadamente 5 x 10 7 células no total).
- Recomenda-se para preparar 3 culturas independentes para 3 peletes de células independentes para obter biológica repetições para cada análise.
- Lisados nucleares são prontamente preparados utilizando o procedimento de isolamento NucBuster (EMD Cat # Calbiochem Bioscience 71.183-3) ALTHough qualquer protocolo de isolamento nuclear seria apropriado (ver abaixo, ponto 2.3.).
2,3 preparação lisado Nuclear
- Antes da partida, um cocktail de Inibidor de Protease liofilizado (Calbiochem, Cat # 539131, Conjunto 1) é primeiro re-suspenso em 100 uL de água estéril para preparar um estoque de 100x. Utilizar imediatamente ou congelar em alíquotas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Calcular 1 uL do estoque 100x para cada 10 7 células extraídas, conforme necessário.
- Todos os passos durante o procedimento de extracção deve ser realizada em gelo ou a 4 ° C para assegurar a estabilidade da proteína.
- Etiqueta 15 ml tubos de Falcon e colocar no gelo.
- Remover meios de crescimento a partir de células e lava-se duas vezes com 7,5 mL de PBS frio.
- Adicionar 5 mL de PBS frio a cada prato e as células de raspar a partir da placa utilizando uma levantador célula. Transferir as células para o 15 mL refrigeradas tubo Falcon.
- Centrifugar a baixa velocidade (500 xg, 4 ° C) durante 5 minutos. Remover o sobrenadantee estimar o volume globular, por comparação. (Até 250 uL de volume de células embalado pode ser processado num tubo mL único 1,5)
- Centrifugar durante mais um minuto a 1 500 xg e remover o PBS restante com uma pipeta. Ressuspender o sedimento de células em NucBuster Reagente de Extracção 1 de acordo com o tamanho do hematócrito: 150 ul de Reagente de Extração NucBuster 1 por volume da célula 50 uL embalado. (Alternativamente, o sedimento de células pode ser rapidamente congelados em gelo seco ou com azoto líquido e armazenadas a -80 ° C até estar pronto para prosseguir).
- Depois de re-suspensão, transferir para um tubo de lisado mL pré-refrigeradas 1,5.
- 15 seg vórtice a alta velocidade, incubar em gelo durante 5 minutos, e novamente vórtice 15 seg a alta velocidade.
- Centrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
- Sobrenadante contém fracção citoplasmática. Retire e guarde a -80 ° C ou descarte.
- Re-suspender o sedimento em uma mistura de 1 uL de re-suspenso Cocktail 100x inibidor de protease, 1 e mu; l de DTT 100 mM e 75 reagente de extração ul NucBuster 2 por volume de 50 ul de células embalado.
- 15 seg vórtice a alta velocidade, incubar em gelo durante 5 minutos, e novamente vórtice 15 seg a alta velocidade.
- Centrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C. Sobrenadante contém proteínas nucleares. Recolher o sobrenadante e prossiga para a próxima etapa.
2,4 Diálise, a quantificação de proteínas e alíquotas
- Todas as etapas durante o procedimento de diálise devem ser realizados com pré-refrigerados soluções, materiais e equipamentos para garantir a qualidade extrato.
- Preparar tampão de diálise (1 L requerido por amostra), como detalhado na Tabela 3. Importante: Tampão deve ser frio (4 ° C). Sugerimos a preparar pelo menos um dia antes. Tampão de diálise filtrada pode ser armazenada a 4 ° C indefinidamente se DTT não tenha sido adicionado.
- Pré-frio copos (2 copos de 1 L por exemplo), tampão de diálise, câmaras de diálise, micro-centrífugatubos, seringas e agulhas.
- Logo antes de usar - adicionar 1 mL 1 M DTT por litro de tampão de diálise.
- Dialisar a lisado preparada no Passo 2,3 em 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerada durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave, utilizando um Slide-A-Lyzer PIERCE cassete de diálise (0,5-3 mL cassetes de diálise com 7.000 de corte MW).
- Transferir cassete de diálise para um segundo béquer contendo 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerados e dializar lisado durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave.
- Recolher a solução de proteína dialisada nuclear da cassete de diálise utilizando uma seringa (Fisher, cat # 309.659). Usar uma junta diferente do utilizado anteriormente para injectar a proteína na cassete de diálise. Note-se que o extracto pode ter cristalizado devido a concentrações de proteína elevadas. Tente incluir nublados cristais olhando ao remover a solução de proteína dialisado nuclear.
- Aliquota da amostra a micro centrífuga-tubos, 20 uL cada uma. Congelamento rápido em gelo seco e store à temperatura de -80 ° C até à utilização.
- Determinar a concentração da proteína dialisada usando protocolos padrão. Exemplos de esperados concentrações lisado nucleares são mostrados na Tabela 4.
- Finalmente, os lisados devem ser avaliados para controlo de qualidade. Avaliação dos lisados irá variar de acordo com a experiência. Como descrito anteriormente, rotineiramente analisar lisados para a expressão de proteínas BER vários via 1,2 immunoblot.
- O passo de diálise é usado para fazer uma solução de reacção uniforme através das linhas de células para facilitar a comparação. Omitindo o passo de diálise pode afectar as taxas de enzimáticas e análise cinética uma vez que as soluções salinas e condições de reacção já não são idênticas nas linhas celulares diferentes e preparações devido às várias diluições necessárias. No entanto, observou-se que utilizando lisados de maior do que 5 ug / uL e adicionando tampão de reacção suficiente não permite omissão da etapa de diálise (dados não mostrados). Para th estudos inibidorem não requerem comparação entre os lisados de células diferentes, a diálise pode não ser necessária. No entanto, é recomendável diálise, como indicado.
3. Ensaio Beacon Molecular
3.1 Requisitos para o equipamento
- Um quantitativa em tempo real instrumento de PCR, como StepOnePlus qRT-PCR ou comparável, ou um fluorómetro placa de 96 poços capaz de detectar e medir a fluorescência FAM em tempo real. Nota: Este procedimento é aplicável a qualquer máquina capaz de ler os valores de fluorescência das balizas e gravá-los em tempo real. A máquina deve, no entanto, permitem ao usuário acessar os valores brutos de fluorescência para análise de dados.
- Centrifugar compatível com ópticas qRT-PCR tubos ou placas sendo usados.
- Microsoft Excel para analisar os dados coletados.
3.2 Buffers e reagentes
- Ópticos qRT-PCR tubos ou placas com tampas correspondentes.
- BER tampão de reacção (ver umaBove e Tabela 2).
- Proteína nuclear dialisada extrai como preparado no Passos 2,3 e 2,4 e diluiu-se a 2 ug / uL de proteína com BER tampão de reacção contendo DTT.
- Balizas molecular diluída para 200 mM com tampão de reacção BER para criar a solução balizas molecular de trabalho (ver acima).
3,3 Ensaio de configuração (Tabela 5)
- A máquina de qRT-PCR não é normalmente usado como um fluorímetro de modo que o método de execução deve ser mudada.
- Programa de uma primeira fase e definir a temperatura da reacção a 37 ° C com um tempo de ciclo (pontos de tempo para as medições) de 20 segundos com um mínimo de 180 ciclos (ou mais, dependendo do desenho do ensaio de reparação). Certifique-se de coletar dados durante os ciclos. Portanto, a máquina irá recolher dados a cada 20 segundos para um total de 1 hr.
- Criar uma segunda fase que as rampas a temperatura a Tmax, da baliza particular, a temperatura com fluorescência máxima, como determinado em Passo 1,3 (avaliação da qualidade do seu farol molecular). O tempo de ciclo deve ser novamente 20 segundos com um total de 15 ciclos. Isto irá recolher dados a cada 20 segundos durante 5 minutos à fluorescência máxima possível da baliza. Os valores de fluorescência medida durante os ciclos a Tmax é usado para normalizar os valores de fluorescência em cada poço (passo 4.2a). Se estiver usando várias balizas diferentes certifique-se de incluir as etapas que fornecem valores similares repetitivos para o Tmax dos faróis também.
- Defina o volume de reação de 25 ul.
- Definir-se o design da placa na máquina qRT-PCR usando o software da Applied Biosystems do. Só estamos interessados nos valores brutos de fluorescência, é só selecionar a "Curva padrão" - tipo de experimento.
- Preencha o layout da placa. Um exemplo é mostrado na Tabela 5. Não acrescentar nada aos poços selecionados como a curva padrão.
3,4 ensaio Run
- Diabinhoortant: material pré-refrigerados Uso e soluções. Mantenha-se fresco até execução e detecção.
- Adicionar quantidade apropriada de DTT para o tampão de reacção BER para ser usado.
- Diluir solução de proteína a uma concentração de 2 ug / uL usando tampão BER reacção (com DTT).
- Para as experiências iniciais, sugerem a utilização 10 ug de lisado nuclear dialisada por poço (5 uL / poço) e 1 pmole de substrato, a baliza molecular a uma concentração de 40 nM final (5 uL / poço). Nós temos consistentemente obtido de alta qualidade e os resultados reprodutíveis com 10 ug de lisado de células, embora seja possível que os lisados de células diferentes ou substratos da baliza podem ditar concentrações de proteína inferiores ou superiores.
- Os componentes de ensaio em cada poço são de 15 uL de tampão de reacção BER, 5 uL baliza e 5 uL de lisado nuclear. Executar cada combinação farol / lisado em triplicata.
- Vários controles negativos são necessários para cada farol, inclusive amostras sem farol, como 25 emu; L de tampão de reacção BER apenas, e 20 uL de tampão de reacção BER com 5 uL lisado e 20 uL de tampão de reacção BER com 5 uL de baliza sem lisado.
- Várias amostras de controlo são necessários para cada lisado nuclear. Estes incluem um controle negativo [15 tampão de reação uL BER, 5 farol controle uL (sem lesão) e 5 lisado amostra uL]. Sugerimos também a incluir experimentais controles positivos, tais como a inclusão de THF contendo balizas que imitam sítio abásico contendo oligos e são facilmente incisão [15 tampão de reação uL BER, 5 uL farol THF e 5 lisado uL da amostra]. Naturalmente, o controlo preciso positiva irá depender da concepção global experimental.
- Como um exemplo, siga Tabela 5 abaixo para a disposição da placa.
- Pipetar em tubos ópticos ou placas, enquanto em gelo ou suporte arrefecida para minimizar a iniciação da reacção antes da detecção do sinal.
- Pipetar tampão de reação BER primeiro em todos os poços.
- O beacons pipeta n de acordo com o layout da placa em poços corretos e sempre pipeta lisados última em poços para minimizar a reação de iniciação antes da detecção do sinal.
- Tubos de vedação ou a placa completamente, misturar e girar com uma centrífuga para reunir as soluções para a parte inferior dos tubos ou placas
- Insira placa em qRT-PCR máquina e começar a ensaio.
- Após a conclusão, exportar dados brutos, de preferência em formato Excel. Para o sistema de StepOnePlus apenas os dados multi-componentes são necessários. Este contém todos os valores de fluorescência no várias leituras classificadas por cor do corante e bem.
4. Análise Ensaio Molecular Beacon
Usamos o software Microsoft Excel para executar essas análises e cálculos. Recomendamos que estabelecem modelos e macros que permitem a análise rápida e fácil e exibe gráficos com base em dados provenientes de formatos padrão de 96 poços.
4,1 remoção do fundo
">Fl 4,2 normalização (Tmax)
Para abordar a variabilidade na pipetagem e detecção de fluorescência em poços diferentes, normalizar os dados para os valores máximos de fluorescência (que se correlacionam com a entrada baliza).
- Calcule os valores médios de fluorescência de ciclos em T max para o indivíduo bem: Fl (T max) (passo 3.3aii).
- Calcule o Fl rácios (ciclo x) / Fl (T max) e multiplicar por 100. Sob a suposição de provável que Fl (T max) corresponde ao valor máximo possível de fluorescência quando totalmente incisão, estes dados normalizados representam% livre FAM (= baliza BER% incisa).
- Combinar as amostras em triplicado calculando a média dos dados (% livre FAM) dos 3 poços para cada ciclo (até o ciclo 180) e calcular os erros em cada um.
- Calcular vezes multiplicando 20 seg a cada ciclo.
- Uma vez que a variância bem-a-bem na detecção de fluorescência pode ser significativo, é recomendável adicionar um corante fluorescente, tais como ROX ao estoque farol molecular que serve como padrão para re-ajustar os valores de fluorescência dos poços individuais. Neste caso, o corante ROX seria utilizado como um padrão interno (referência passiva) em cada único poço. ROXOs espectros de excitação e emissão (excitação - 588 nm, emissão nm 608) é distinta da do corante 6-FAM utilizado no ensaio (excitação - 495 nm, emissão - 520 nm). O corante ROX permitiria um passo de normalização semelhante ao RT-PCR convencional procedimentos que permite que a normalização de bem-a-assim diferenças que podem ocorrer devido a artefactos. Estes podem resultar de pipetagem erros ou podem ser originários de bem-a-assim variação na eficiência de detecção de fluorescência.
4,3 Plot
- Lote dados de fluorescência normalizados (% livre FAM) contra o tempo (em segundos) em um gráfico de dispersão com os erros correspondentes.
- Sugerimos análise cinética de reparação em pelo menos três diferentes preparações de lisados nucleares que representam repetições biológica. Para avaliar a variação, inter-experimentais erros calculados a partir das médias de cada experiência individual deve ser exibido.
- Uma análise representativa de dois lisados de células tumorais: LN428, um gliomalinha de células com níveis indetectáveis de metil purina DNA glicosilase (MPG) e LN428/MPG, a linha celular mesmo concebido para expressão elevada de MPG; ambas as linhas celulares têm níveis equivalentes de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Cada foram sondadas para APE1 actividade e actividade MPG usando o BER THF Molecular Beacon (Figura 3) e do BER Hx Molecular Beacon (Figura 4), onde THF = tetra-hidrofurano (um substrato para APE1) e Hx = hipoxantina (um substrato para MPG) . Nota: Na Figura 3 (substrato THF), os resultados dos lisados LN428/MPG mostram uma baixa fluorescência máxima absoluta, em comparação com os LN428 lisados. Este é o resultado de um valor mais baixo farol de entrada, tal como determinado usando valores Tmax (ver 3.3a). Quando este valor mais baixo foi usada para normalizar os resultados, que resulta em uma grande alteração na trama. Esta bem ilustra a importância de normalizar os dados. Plotando os valores absolutos de fluorescência por si só, sugerem a repaas taxas de infravermelho entre LN428 e as células LN428/MPG são diferentes. No entanto, quando os dados são normalizados para considerar a variabilidade bem-a-assim, o APE1 mediada diferença da taxa de reparação é mostrado para ser mínima.
5. Os resultados representativos
Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular (Figura 1). Uma vez recozido, sugerimos realizar uma análise da curva de fusão (Tabela 1) como uma avaliação da qualidade do seu farol molecular (Figura 2). Lisados nucleares podem então ser preparados, utilizando os componentes do tampão listados na Tabela 2. Dialisar a lisado em 0,5 L de tampão de diálise pré-refrigerada durante 90 minutos a 4 ° C com agitação suave, utilizando uma cassete de diálise PIERCE Slide-A-Lyzer contra o tampão de diálise listados na Tabela 3. Recolher osolução de proteína dialisada nuclear da cassete de diálise utilizando uma seringa. Usar uma junta diferente do utilizado anteriormente para injectar a proteína na cassete de diálise. Determinar a concentração da proteína dialisada usando protocolos padrão. Exemplos de esperados concentrações lisado nucleares são mostrados na Tabela 4. Executar a reacção, tal como indicado acima (passo 3.4), utilizando o esquema de placa, como mostrado na Tabela 5. Uma análise representativa de dois lisados de células tumorais: LN428, uma linha celular de glioma com níveis indetectáveis de metil purina DNA glicosilase (MPG) e LN428/MPG, a linha celular mesmo concebido para expressão elevada de MPG; ambas as linhas celulares têm níveis equivalentes de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Cada foram sondadas para APE1 actividade e actividade MPG usando o BER THF Molecular Beacon (Figura 3) e do BER Hx Molecular Beacon (Figura 4), onde THF = tetra-hidrofurano (um substrato para APE1) e Hx = hipoxantina(Um substrato para MPG). Finalmente, usando uma dU BER / A farol molecular que relatórios sobre a actividade glicosilase de uracilo, mostramos que a saída de sinal ou a força do sinal é máxima no 10μg de proteína e diminui para um nível indetectável em 0,62 mg de proteína (Figura 5).
Figura 1. Estrutura global da baliza BER Molecular. É mostrada a sequência e concepção global das balizas BER Molecular aqui utilizadas como uma molécula de cadeia simples, depois do recozimento e novamente depois de fusão. O negrito, itálico porção da sequência é a haste (15 bases) ea porção sublinhada da sequência é a malha (13 bases). FAM = 5 'corante fluorescente 6-Carboxifluoresceína [na extremidade 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, coeficiente de extinção (260 nm): 20.960; coeficiente de extinção (no absorvância max): 75.000] e DABCYL = o quenching 3 'agente Dab cil [no extremo 3 '; Abmax = 453 nm; Faixa Quenching = 425-520 nm] X = lesão (varia de acordo com a questão de pesquisa) e Y = base o oposto da lesão (varia de acordo com a questão de pesquisa). .
Figura 2. Derreter Curva. Uma curva de fusão representativo é mostrado para o controle da baliza BER Molecular (A), e as balizas BER molecular contendo o tetra-hidrofurano porção (THF) (B) ou a porção Hipoxantina (Hx) (C). Concentrações de oligonucleotídeos variou de 0 nM (azul escuro), 8 nm (vermelho), 16 nm (verde), 32 nm (violeta), 64 nM azuis para 128 nM (laranja). Tal como descrito no Passo 1,3, os oligonucleótidos hibridados foram aquecidos de 25 ° C a 95 ° C em 0,5 ° C intervalos e do sistema de StepOnePlus é programado para medir FAM fluorescência em cada intervalo de 0,5 ° C.
Figura 3. Os dados representativos utilizando o BER THF farol molecular. AP actividade de endonuclease específica para a hidrólise do sítio abásico analógico tetra-hidrofurano (THF) foi medido em lisados nucleares a partir da linha celular de controlo (LN428) ea MPG a sobre-expressão linha de células (LN428/MPG) . Cada lisado foi analisada usando o BER Controle Beacon Molecular (LN428, verde; LN428/MPG, púrpura) ou a BER THF Molecular Beacon (LN428, azul; LN428/MPG, vermelho). Os resultados são reportados como (a) a média unidades de resposta de fluorescência e (B) os mesmos dados normalizados para a entrada baliza como descrito na Secção 4 acima (THF = tetra-hidrofurano).
Figura 4. Os dados representativos utilizando o BER Hx Molecular Beacon actividade glicosilase de ADN específico para a remoção do substrato MPG hypoxanthine (Hx) foi medido em lisados nucleares a partir da linha celular de controlo (LN428) ea MPG a sobre-expressão linha de células (LN428/MPG). Cada lisado foi analisada usando o BER Controle Beacon Molecular (LN428, verde; LN428/MPG, púrpura) ou a BER Hx Molecular Beacon (LN428, azul; LN428/MPG, vermelho). Os resultados são reportados como (a) a média unidades de resposta de fluorescência e (B) os mesmos dados normalizados como descrito na Secção 4 acima (Hx = hipoxantina).
Figura 5. Os dados representativos utilizando o dU BER / A farol molecular em diferentes níveis de proteína. DNA glicosilase (UNG) actividade específica para a remoção de uracilo (dU / A) foi medido em lisados nucleares a partir de células T98G. O lisado T98G foi analisada utilizando o BER Controlo farol molecular ou o dU BER / A farol molecular, em níveis de proteína de 10, 5, 2,5, 1,25 ou 0,62 ug, tal como indicado na fIGURA. Os resultados são dados normalizados conforme descrito na Seção 4 acima.
| Concentração de baliza (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| Solução Beacon Molecular de trabalho (200 nm) adicional (uL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER tampão de reacção (w / o DTT) (uL) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
Tabela 1. Esquema de um experimento de curva de fusão.
| 1 Total L | Volume da solução de reserva necessária | Con. da solução de reserva | Con Final. |
| HEPES-KOH | 25 mL | 1M pH 7,8 | 25 mM </ Td> |
| KCl | 75 mL | 2 M | 150 mM |
| EDTA | 1 mL | PH 8,0 0,5 M | 0,5 mM |
| Glicerina | 10 mL | N / A | 1% |
| DTT (adicionar antes do uso) | 0,5 mL | 1 M | 0,5 mM |
| H 2 S | 888,5 mL | N / A | N / A |
Tabela 2. BER tampão de reacção.
| 1 Total L | Volume da solução de reserva necessária | Con. da solução de reserva | Con Final. |
| HEPES-KOH | 50 mL | 1M pH 7,5 | 50 mM |
| KCl | 50 mL | 2 M | 100 mM |
| EDTA | 1 mL | PH 8,0 0,5 M | 0,5 mM |
| Glicerina | 200 mL | N / A | 20% |
| DTT (adicionar antes do uso) | 1 mL | 1 M | 1 mM |
| H 2 S | 698 mL | N / A | N / A |
Tabela 3. Tampão de diálise.
| Linha de células | Concentração de proteína (mg / mL) |
| LN428 | 5,34 |
| LN428/MPG | 4,79 |
Tabela 4. Determinação resultados de proteína.
| Controlo Negativo 25μL BER Tampão | (Controle de Fundo) 20 uL BER Tampão 5μL Con Beacon NO lisado | (Teste em triplicado) <br /> 15μL BER Tampão 5μL Con Beacon 5μL LN428 Lysate | (Teste em triplicado) BER 15μL tampão 5μL Con Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
| Controlo Negativo 25μL BER Tampão | (Controle de Fundo) 20 uL BER Tampão 5μL THF Beacon NO lisado | (Teste em triplicado) 15μL BER Tampão 5μL THF Beacon 5μL LN428 Lysate | (Teste em triplicado) 15μL BER Tampão 5μL THF Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
| Controle Negativo 20 uL BER Tampão 5μL lisado | (Controle de Fundo) 20 uL BER Tampão 5μL Hx Beacon NO lisado | (Teste em triplicado) BER 15μL tampão 5μL Hx Beacon 5μL LN428 Lysate | (Teste em triplicado) 15μL BER Tampão 5μL Hx Beacon Ly LN428/MPG 5μLsaciar |
| Controle Negativo 20 uL BER Tampão 5μL lisado |
Tabela 5. Ensaio Beacon Molecular set-up.
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Discussion
Existem mais de 600 citações usando "farol molecular" o prazo para detectar e quantificar as inúmeras moléculas e as atividades enzimáticas, incluindo atividade de helicase 6, atividade DNA polimerase 7,8, a atividade DNA ligase 9, a atividade da telomerase 10, a atividade DNA fotoliase 11 e DNA / RNA híbridos 12, entre muitos outros. Além da utilização de balizas molecular para a medição das actividades de ADN de reparação listados acima, nós e outros demonstraram a utilidade destas sondas para a análise de BER actividade 1,2,13-15.
O tempo real ensaio de actividade BER descrevemos aqui incorpora uma única base modificada e permite a avaliação quantitativa das taxas de BER para diferentes lesões ou alterações na base oposto da lesão. As aplicações podem variar de estudos moleculares mecanicistas às telas inibidores. Nós demonstramos especificidade BER comparando Lysates de MPG células que expressam com não-células que expressam e falta de atividade na beacons controle. O ensaio é altamente sensível, permitindo a detecção de defeitos na expressão de proteínas a MPG BER 2 ou XRCC1 1 e é suficiente para detectar pequenas alterações nos parâmetros de ADN de reparação cinéticos e da eficácia dos inibidores de reparação do ADN [manuscrito em preparação]. Várias leituras ao longo do apoio ativo o tempo de reparação calcularam as taxas cinéticas ea importância em quaisquer mudanças nessas taxas cinéticas. O RIC ensaio farol molecular é, portanto, adequada para alto rendimento estudos para a tela para os inibidores de enzimas de reparo do DNA (telas de inibidores) ou para estudos sobre o papel de cada um dos componentes nucleares. A análise dos lisados nucleares permite a avaliação de reparação do ADN no contexto completa do complexo de BER, consequentemente, também descreve as alterações indirectas ou influências sobre a maquinaria BER (por exemplo, modificações pós-tradução ou mutações).
Oprotocolo, como descrito, deve produzir resultados altamente reprodutíveis e quantitativa. No entanto, existem vários detalhes a considerar para garantir a análise apropriada: (1) Os valores de fundo de controlos negativos pode ser demasiado elevado: Isto pode ser devido a mau armazenamento ou o fabrico do oligonucleótido. Valores de fundo de alta nos lisados sem balizas indicam fluorescência auto confusão (ou seja, contaminação ou expressão celular de proteínas fluorescentes exógenos). Se a expressão de uma proteína fluorescente é inevitável, os espectros de excitação / emissão para o corante repórter e proteína fluorescente não podem sobrepor-se, (2) Fl (Tmax) é baixa: concentração de ADN é diferente do dado. Verifique a concentração de DNA por espectrofotometria (OD 260 nm), por exemplo, utilizando o Nanodrop. Alta concentração de DNA com baixo Fl (Tmax) indica um carregamento FAM insuficiente sobre as balizas. Purificação por HPLC impede a contaminação com ADN não modificado (ver acima), (3) actividade de reparação é pobre: Se o FL (Tmax) valores emúltimos ciclos indicam entrada baliza suficiente e detecção por fluorescência, isto pode sugerir que a preparação extracto nuclear falhou. Qualidade extrato nuclear é crucial. Baixas temperaturas deve ser assegurada durante todo o procedimento incluindo armazenamento a longo prazo a -80 ° C e (4) as curvas de actividade de reparação iniciar com valores elevados de exposição: Mesmo muito curto das amostras à temperatura ambiente antes da análise inicia reparação. Mantenha fresco em todos os momentos.
Este ensaio BER altamente sensível e quantitativo é também aplicável para a análise de proteínas purificadas, permitindo estudos sobre a especificidade do substrato, alterando as balizas molecular em conformidade. Finalmente, o ensaio é aplicável a análise de tumor e os lisados de tecido, proporcionando uma oportunidade para medir parâmetros de reparação de ADN funcionais como biomarcadores de resposta ou a eficácia terapêutica, como já sugerido para avaliar tumores para PARP1 potenciação inibidor da temozolomida agente alquilante 2.
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Disclosures
RWS é consultor científico Trevigen, Inc. O resto dos autores declaram que não existem conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Pittsburgh e pelo National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Suporte para o Mecanismo de UPCI Lentivirus foi fornecido RWS pela Grant Suporte Cancer Center do National Institutes of Health [P30 CA047904]. O suporte também foi fornecida pelo Departamento da Universidade de Pittsburgh de Farmacologia e Biologia Química para DS. Foi também prestado apoio por ESTRO para CV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
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