Summary

定量,实时分析,利用分子信标病​​变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动

Published: August 06, 2012
doi:

Summary

我们描述了DNA糖基化酶和AP内切酶的活动,在核细胞裂解定量,实时测量的方法。该法产生服从动力学分析DNA修复活动率,是适应组织和肿瘤裂解物或纯化蛋白质的DNA修复能力的量化。

Abstract

我们描述了一个定量,实时测量碱基切除修复(BER)的分子信标DNA糖基化酶和AP内切酶的活动,在核细胞裂解方法。基板(灯塔)是由deoxyoligonucleotide包含单碱基损伤与6 – 羧基荧光素(6-FAM)基团结合到5'端和DABCYL基的共轭寡核苷酸的3'结束。 BER分子信标是43基地在长度和序列的目的是为了促进与13环和15个碱基对中干1,2个核苷酸的茎环结构的形成。在此配置折叠时6-FAM基淬火DABCYL非荧光的方式通过福斯特共振能量转移(FRET)3,4。病变位置等基地,以下病灶切除和链的断裂,其余5个基地的寡核苷酸,含6-FAM基干公布。释放第二支队从猝灭(DABCYL)荧光的增加,DNA修复水平是相称的结果。通过收集多个读取的荧光值,实时误码活动的评估是可能的。标准定量实时PCR仪器的使用,使许多样品同时分析。这些BER分子信标设计,用一个单一的基础病变,是适合进行动力学分析,误码率的量化和抑制剂验证,是适应组织和肿瘤细胞裂解物中的DNA修复能力的量化或用纯化的蛋白质。在肿瘤裂解物或使用这些分子信标组织抽吸的BER活动的分析,可能是适用于功能性的生物标志物的测量。此外,使用这种定量检测与纯化蛋白质的BER活动分析,误码率抑制剂的发现和验证提供了一种快速,高通量的方法。

Protocol

1。分子信标设计 1.1设计和分子信标订购您的分子信标设计必须考虑以下几点: 我们有43-MER DNA寡核苷酸,有良好的效果。 GC含量应大于32%。排除在G碱基的5'端。 6-FAM(6 – 羧基)共轭上的5'端和“修改为3 DABCYL请求。 病变的位置,应该是基地,从5'端#6。 干或发夹双工的长度应该是至少15个基点。 建…

Discussion

有超过600个使用“分子信标”检测和量化许多分子和酶的活动,包括解旋酶的活性,DNA聚合酶活性7,8,DNA连接酶的活动9,10端粒酶活性,DNA光解酶的活性11和DNA /引用许多人的RNA之间的杂交种12。除了 ​​利用分子信标测量DNA修复上面列出的活动,我们和其他人已经证明误码活动1,2,13-15分析这些探头的效用。

实时BER活性测定,我们描述…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

从匹兹堡基金会和国家卫生研究院(NIH)的[GM087798; CA148629; ES019498] RWS的赠款,以支持这项工作。 UPCI慢病毒设施的圣淘沙名胜世界提供了支持,从国家卫生研究院癌症研究中心支援津贴[P30的CA047904]。由美国匹兹堡大学的药理学部化学生物学的DS也提供了支持。也提供了支持ESTRO到CV。

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
EDTA Fisher BP120-500  
Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
DTT Fisher BP172-5  
HEPES- Solution Invitrogen 15630  
HEPES-Salt Sigma H4034-500G  
Potassium Hydroxide Sigma 17-8  
0.22μM filter Nalgene 167-0020  
Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
Syringe Fisher 309659  
Needle Fisher 305196  
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
15 mL Falcon Tubes Fisher 352097  
NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183  
PBS Invitrogen 14190  
Molecular Beacons IDT    
BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006  

References

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Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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