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Biology

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.

Abstract

Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons. Das Substrat (Beacon) aus einem Deoxyoligonukleotid enthaltend eine einzelne Base Läsion mit einem 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) konjugiert an die 5'-Ende und ein DABCYL-Rest konjugiert an das 3'-Ende des Oligonukleotids umfaßt. Die BER Molecular Beacon ist 43 Basen Länge und die Sequenz wurde entwickelt, um die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur mit 13 Nukleotiden in der Schleife und 15 Basenpaaren in dem Schaft 1,2 zu präsentieren. In dieser Konfiguration geklappt und der 6-FAM-Einheit durch Dabcyl in einem nicht-fluoreszierenden Weise über Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4 abgeschreckt. Die Läsion ist so, dass die folgenden Basis-Läsion Entfernung und Strangbruch die restlichen 5 Basis-Oligonukleotid mit der 6-FAM-Rest vom Stamm gelöst wird positioniert. Lassen Sie einRunde Ablösung von den Quencher (Dabcyl) führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die im Verhältnis zu der Ebene der DNA-Reparatur. Durch das Sammeln mehrerer liest der Fluoreszenz-Werte, ist eine Echtzeit-Bewertung von BER-Aktivität möglich. Der Einsatz von Standard quantitative Echtzeit-PCR-Instrumente erlaubt die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben. Das Design dieser BER Molecular Beacons mit einer einzigen Basisstation Läsion, zugänglich ist, um kinetische Analysen, Quantifizierung und BER-Inhibitor Validierung und anpassbar ist für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität in Gewebe und Tumor Zelllysaten oder mit gereinigten Proteinen. Die Analyse der BER-Aktivität in Tumorlysaten oder Gewebe saugt Verwendung dieser Molecular Beacons kann für funktionelle Biomarker Messungen. Ferner stellt die Analyse von BER-Aktivität mit gereinigten Proteinen mit diesen quantitativen Assay eine schnelle, High-Throughput-Verfahren zur Identifizierung und Validierung von BER-Inhibitoren.

Protocol

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1. Molecular Beacon Design-

1,1 Gestaltung und Bestellung Ihrer Molecular Beacon

Das Design Ihres Molecular Beacon müssen Sie Folgendes berücksichtigen:

  1. Wir haben gute Ergebnisse mit 43-mer DNA-Oligonukleotiden. Der GC-Gehalt sollte> 32% betragen. Ausschließen einer Base G am 5'-Ende.
  2. Anfordern 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) Konjugation auf das 5'-Ende und Dabcyl als eine 3'-Modifikation.
  3. Die Position der Läsion sollte auf der Basis Nr. 6 vom 5'-Ende.
  4. Die Länge des Stamm-oder Duplex-Haarnadel sollte ein Minimum von 15 bp sein.
  5. Die empfohlene Loop-Länge beträgt 13 Basen.
  6. Die allgemeine Struktur der Bake ist, wie in 1 gezeigt.
  7. Sobald die Sequenz und Läsion-Typ entschieden wird, kann das Oligonukleotid von den meisten Unternehmen Oligonukleotid bestellt werden. Wir bestellen unsere Oligonukleotide von IDT und verlangen, dass die Oligonukleotide HPLC gereinigt und sind provided als Pulver oder in einer getrockneten Form.

1,2 Glühen Ihre Molecular Beacon

  1. Man löst lyophilisierte DNA-Oligonukleotide in Oligo Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA), um eine konzentrierte Molecular Beacon Stammlösung von 40 mu m.
  2. Bereiten Sie eine 200 nM Molecular Beacon funktionierende Lösung aus dem 40 uM Molecular Beacon Stammlösung mit der BER-Reaktionspuffer (siehe unten). Fügen Sie die 200 nM Molecular Beacon funktionierende Lösung in ein steriles 1,5 ml schwarze Röhre.
  3. Inkubieren Sie die Röhrchen mit dem 200 nM Molecular Beacon Arbeitslösung in einem großen Becherglas mit kochendem Wasser für 3 Minuten.
  4. Nach 3 Minuten nimmt das Becherglas von der Wärmequelle und bebrüten die Molecular Beacons im Wasser über Nacht zum Glühen zu fördern. Verwendung wärmedämmender Materialien sowohl über als auch unter dem Becher, um die Kühlung zu verlangsamen.
  5. Aliquotieren Beacons in sterile, schwarz 1,5 ml Röhrchen wurden 100 ul für jedes Röhrchen.
  6. Lagerung bei -30 ° C.

1,3 Qualitätsbewertung Ihrer Molecular Beacon

  1. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse zu bestätigen, dass die BER Molecular Beacons fluoreszieren nicht, bis beheizt, um die optimale Schmelztemperatur bestimmen und zu bestätigen, dass jede Bake wird fluoreszieren, wenn sie erhitzt.
  2. Für jede Bake die angegebene Menge von 200 nM der Molecular Beacon Arbeitslösung und BER Reaktionspuffer hinzugefügt, wie in Tabelle 1 angegeben, Anspruch 6 Vertiefungen einer schnellen optischen Platte mit 96 Vertiefungen (Applied Biosystems, Kat. Nr. 4.346.906).
  3. Verwenden Sie ein Echtzeit-PCR-Instrument wie die StepOnePlus (Applied Biosystems)-System oder ähnlich FAM-Farbstoff Erregung während der Schmelzkurvenanalyse überwachen.
  4. Programmieren Sie Ihre Echtzeit-PCR-Instrument (StepOnePlus System) zu Farbstoff FAM Anregung als Funktion der Erhöhung der Temperatur in kleinen Schritten für Schmelzkurvenanalyse überwachen. Die StepOnePlus ist so programmiert, FAM zu messen fluoreszierennce und Rampe von 25 ° C bis 95 ° C in 0,5 ° C Intervallen. Eine typische Schmelzkurve ist in 2 gezeigt.
  5. Wenig oder keine Hintergrundfluoreszenz sollte bei Temperaturen unter 50 ° C sichtbar Überprüfen Sie für eine einheitliche und steilen Anstieg der Fluoreszenz, was auf reine, hochwertige Beacons. Tm-Werte um 60 ° C bis 80 ° C günstig sind, sollte gleich für alle Verdünnungen.
  6. Bestimmen T max, die Temperatur, bei maximale Fluoreszenz [Fl (max)]-Werte aus dieser Analyse. Die Verhältnismäßigkeit der Fluoreszenz-Werte bei T m oder T max auf der Bake-Eingang (die Konzentration) sollte linear sein. Die Fluoreszenz ist bei T max, Fl (max), sollte Hintergrundwerte bei 37 ° C mindestens 5-fach übersteigt.

2. Nuclear Lysatpräparat

2,1 Base Excision Repair Reaktionspuffer 5 Vorbereitung

  1. Fügen Sie alle aufgeführten Komponentenin Tabelle 2 und bringe das Volumen des Puffers auf 900 ml mit ddH 2 O
  2. Der pH-Wert auf 7,8 mit Kaliumhydroxid 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
  3. Bringe das Volumen des Puffers auf 1000 ml mit ddH 2 O
  4. Filtern Sie den Puffer mit 0,22 um Filter, Nalgene 1 L-Filter (cat # 167-0020).
  5. Fügen Sie Dithiothreitol (DTT) unmittelbar vor der Verwendung des BER Reaktionspuffer.

2,2 Zellkultur-und Zell-Isolierung

  1. Es wird zur Kultivierung von Zellen, bis zu 90-100% konfluent vorgeschlagen. Isolierung von Zellen, 4-6 Schalen (150 mm), um eine ausreichende atomare Lysat für einen vollen Satz von Analysen (etwa 5 x 10 7 Zellen insgesamt) zu erhalten.
  2. Es wird empfohlen, 3 unabhängige Kulturen für 3 unabhängige Zellpellets vorbereiten zu erhalten biologischen Wiederholungen für jede Analyse.
  3. Nuclear Lysate werden leicht unter Verwendung der NucBuster Isolierungsverfahren (EMD Bioscience Calbiochem Kat. Nr. 71183-3) ALTHough jede nukleare Isolation Protokoll angemessen wäre (siehe unten, Abschnitt 2.3.).

2,3 Nuclear Lysatpräparat

  1. Vor dem Start wird eine lyophilisierte Protease Inhibitor Cocktail (Calbiochem, Kat. Nr. 539131, Satz 1) zunächst in 100 ul sterilem Wasser resuspendiert, um eine 100x Lager vorzubereiten. Sofort verwenden oder in Aliquots bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. Berechnen Sie 1 ul der 100x-Lager für je 10 7 Zellen extrahiert, wie gebraucht.
  2. Alle Schritte während der Extraktion sollten auf Eis oder bei 4 ° C durchgeführt werden, um die Stabilität von Proteinen zu gewährleisten.
  3. Label 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis stellen.
  4. Entfernen Sie das Wachstum von Zellen und Medien waschen zweimal mit 7,5 ml kaltem PBS.
  5. In 5 ml kalter PBS zu jeder Schale und abzuziehen Zellen von der Platte unter Verwendung einer Zelle Heber. Übertragen Zellen in das gekühlte 15 ml Falcon-Röhrchen.
  6. Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit (500x g, 4 ° C) für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstandund eine Schätzung des Hämatokrits durch Vergleich. (Bis zu 250 ul Hämatokrit können in einer einzigen 1,5-ml-Tube verarbeitet werden)
  7. Zentrifuge nochmals 1 min bei 500 xg und entfernen Sie die restlichen PBS mit einer Pipette. Zellpellet in NucBuster Extraktionsreagenz 1 nach der Größe des Hämatokrit: 150 ul NucBuster Extraktion Reagenz 1 pro 50 pl Hämatokrit. (Alternativ kann das Zellpellet sein tiefgefroren auf Trockeneis oder mit flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zum Gebrauch vorgehen).
  8. Nach Resuspension, übertragen Lysat auf eine vorgekühlte 1,5 ml Tube.
  9. Vortex 15 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, auf Eis für 5 Minuten inkubiert, und Wirbel wieder 15 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit.
  10. Zentrifugieren bei 13.000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C
  11. Der Überstand enthält zytoplasmatischen Fraktion. Entfernen und aufbewahren bei -80 ° C oder zu verwerfen.
  12. Resuspendieren des Pellets in einer Mischung aus 1 ul resuspendierten 100x Protease Inhibitor Cocktail, 1 & mu; l von 100 mM DTT und 75 ul NucBuster Extraktionsreagenz 2 pro 50 pl Hämatokrit.
  13. Vortex 15 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, auf Eis für 5 Minuten inkubiert, wieder Wirbel 15 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit.
  14. Zentrifugieren bei 13.000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C Überstand enthält nuklearer Proteine. Den Überstand abnehmen und gehen Sie zum nächsten Schritt.

2,4 Dialyse-, Protein-Quantifizierung und Aliquotierung

  1. Alle Schritte während der Dialyse Verfahren sollte mit vorgekühlten Lösungen, Materialien und Geräte durchgeführt werden, um Extrakt Qualität zu gewährleisten.
  2. Bereiten Dialysepuffer (1 l pro Probe erforderlich), wie in Tabelle 3. Wichtig: Buffer sollte kalt (4 ° C). Wir empfehlen mindestens einen Tag vor der Zubereitung. Gefilterte Dialysepuffer können bei 4 ° C gelagert werden auf unbestimmte Zeit, wenn DTT wurde nicht hinzugefügt.
  3. Pre-Chill-Becher (2 von 1 l Becher pro Probe), Dialyse-Puffer, Dialyse-Kammern, Mikro-ZentrifugeSchläuche, Spritzen und Nadeln.
  4. Unmittelbar vor der Weiterverarbeitung - 1 ml 1 M DTT pro Liter Dialysepuffer.
  5. Dialysieren des Lysats in Schritt 2.3 in 0,5 L vorgekühlte Dialyse-Puffer für 90 Minuten hergestellt bei 4 ° C unter leichtem Rühren unter Verwendung eines Pierce Slide-A-Lyzer Dialysekassette (0,5-3 ml Dialyse Kassetten mit 7.000 MW Cut-off).
  6. Übertragen Dialysekassette mit einem zweiten Becherglas mit 0,5 L vorgekühlte Dialysepuffer dialysiert und Lysat für 90 Minuten bei 4 ° C unter leichtem Rühren.
  7. Sammeln Sie die dialysierte nuklearen Protein-Lösung aus der Dialyse-Kassette mit einer Spritze (Fisher, Kat. Nr. 309659). Verwenden eines anderen Dichtung als bisher um das Protein in der Dialysekassette Injektion verwendet. Beachten Sie, dass der Extrakt durch hohe Proteinkonzentrationen zu kristallisieren. Versuchen Sie, trüb aussehende Kristalle beim Entfernen des dialysierten nuklearen Protein-Lösung gehören.
  8. Aliquot der Probe auf Mikro-Zentrifugenröhrchen, 20 ul je. Quick-Freeze auf Trockeneis und Lagerunge bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  9. Die Konzentration der dialysierte Proteinlösung nach üblichen Verfahren. Beispiele der zu erwartenden nuklearen Lysat-Konzentrationen sind in Tabelle 4 gezeigt.
  10. Schließlich sollte Lysate für die Qualitätskontrolle ausgewertet werden. Bewertung der Lysate werden mit der Tests variieren. Wie zuvor beschrieben, wir routinemäßig für die Expression analysiert Lysaten von mehreren Proteinen durch Immunoblot BER 1,2.
  11. Die Dialyse Schritt verwendet wird, um eine gleichmäßige Reaktionslösung über die Zelllinien zu den Vergleich zu erleichtern. Das Weglassen des Dialyseschritt beeinträchtigen enzymatische Preise und kinetische Analyse, da die Salzlösungen und Reaktionsbedingungen nicht mehr identisch in den verschiedenen Zelllinien und Zubereitungen aufgrund der verschiedenen Verdünnungen erforderlich sind. Wir haben jedoch festgestellt, dass mit Lysaten von mehr als 5 g / ul und dass eine ausreichende Menge Reaktionspuffer wird Wegfall der Dialyseschritt (Daten nicht gezeigt) zu ermöglichen. Für Inhibitorstudien thbei nicht nur im Vergleich zwischen verschiedenen Zell-Lysaten, kann eine Dialyse nicht erforderlich. Wir empfehlen jedoch, Dialyse, wie angegeben.

3. Molecular Beacon Assay

3,1 Betriebsmittelanforderungen

  1. Eine quantitative Echtzeit-PCR-Instrument, wie StepOnePlus qRT-PCR oder vergleichbar, oder einer 96-Well-Platte Fluorometer in der Lage zu erkennen und zu messen FAM-Fluoreszenz in Echtzeit. Hinweis: Dieses Verfahren gilt für jede Maschine in der Lage, die Fluoreszenz-Werte der Baken zu lesen und speichert sie in Echtzeit. Die Maschine sollte jedoch dem Benutzer erlauben, die rohen Fluoreszenz-Werte für die Datenanalyse zugreifen.
  2. Zentrifugieren kompatibel mit optischen qRT-PCR-Röhrchen oder Platten verwendet wird.
  3. Microsoft Excel zu analysieren, Daten gesammelt.

3,2 Puffer und Reagenzien

  1. Optische qRT-PCR-Röhrchen oder Platten mit entsprechenden Abdeckungen.
  2. BER Reaktionspuffer (siehe aBove und Tabelle 2).
  3. Dialysierten Kernprotein extrahiert wie in den Schritten 2.3 und 2.4 hergestellt und verdünnt bis 2 ug / ul Protein mit BER Reaktion Puffer mit DTT.
  4. Molecular Beacons bis 200 um mit BER Reaktionspuffer verdünnt, um die Molecular Beacons funktionierende Lösung (siehe oben) zu schaffen.

3,3-Test Set-up (Tabelle 5)

  1. Die qRT-PCR-Maschine wird normalerweise nicht als Fluorimeter eingesetzt, so dass die run-Methode geändert werden muss.
    1. Programm eine erste Stufe und stellen Sie die Reaktionstemperatur auf 37 ° C mit einer Zykluszeit (Zeit Punkte für Messungen) von 20 Sekunden mit einem Minimum von 180 Zyklen (oder mehr, abhängig von der Reparatur-Assay-Design). Vergewissern Sie sich, um Daten während der Zyklen zu sammeln. Daher wird die Maschine zu sammeln Daten alle 20 Sekunden für insgesamt 1 Stunde.
    2. Erstellen Sie eine zweite Stufe, die Rampen, um die Temperatur Tmax des jeweiligen Leuchtfeuer, die Temperatur mit maximale Fluoreszenz, als Abschreckungvermint in Schritt 1.3 (Qualitätsbewertung Ihrer Molecular Beacon). Die Zykluszeit sollte wieder 20 sec sein, mit insgesamt 15 Zyklen. Diese sammelt die Daten alle 20 Sekunden für 5 Minuten bei der maximalen Fluoreszenz möglich die Bake. Die Fluoreszenz-Werte während der Zyklen bei Tmax, wird dazu verwendet, um die Fluoreszenzwerte in jeder Vertiefung (Schritt 4.2a) zu normalisieren. Bei Verwendung von mehreren verschiedenen Baken achten Sie darauf, sich wiederholende Schritte, die ähnliche Werte für die Tmax jener Leuchttürme bieten ebenfalls berücksichtigt werden.
    3. Stellen Sie den Reaktionsvolumen auf 25 ul.
  2. Set-up der Platte Design auf der qRT-PCR-Maschine mit dem Applied Biosystems-Software. Wir sind nur in der rohen Fluoreszenz-Werte interessiert, so wählen Sie die "Standard-Kurve" - ​​Experiment Typ.
  3. Füllen Sie das Platinenlayout. Ein Beispiel ist in Tabelle 5 gezeigt. Nichts hinzufügen, um die Vertiefungen als Standard-Kurve ausgewählt.

3,4 Run-Test

  1. Koboldortant: Verwenden Sie vorgekühlte Material und Lösungen. Halten Sie bis zur Laufzeit und zum Nachweis cool.
  2. In geeigneten Menge von DTT in den BER-Reaktionspuffer verwendet werden.
  3. Verdünnte Proteinlösung auf eine Konzentration von 2 g / ul den BER-Reaktionspuffer (mit DTT).
  4. Für erste Versuche schlagen wir vor, 10 ug dialysierten nuklearen Lysat pro Well (5 ul / well) und 1 pmol Substrat, das Molecular Beacon bei einer 40 nM Endkonzentration (5 ul / well) zu verwenden. Wir haben eine gleichbleibend hohe Qualität und reproduzierbare Ergebnisse mit 10 ug Zelllysat erhalten, obwohl es möglich ist, dass verschiedene Zelllysaten oder Leuchtfeuer Substrate kann höher oder niedriger Proteinkonzentrationen diktieren.
    1. Die Assay-Komponenten in jedem gut sind 15 ul BER Reaktionspuffer, 5 ul Leuchtfeuer und 5 ul nuklearen Lysat. Führen Sie jeden Bake / Lysat Kombination in dreifacher Ausfertigung.
    2. Mehrere negative Kontrollen werden für jedes Leuchtfeuer erforderlich, einschließlich Proben ohne Leuchtfeuer wie 25 μ L von BER Reaktionspuffer nur, und 20 ul BER Reaktionspuffer mit 5 ul Lysat und 20 uL BER Reaktionspuffer mit 5 ul Lysat ohne Leuchtfeuer.
    3. Mehrere Kontrollproben werden für jedes Kernkraftwerk Lysat erforderlich. Dazu gehören eine Negativ-Kontrolle [15 ul BER Reaktionspuffer, 5 ul Kontrolle Leuchtfeuer (keine Läsion) und 5 ul Probenlysat]. Wir schlagen außerdem vor, experimentelle positive Kontrollen, wie die Aufnahme von THF mit Baken, die Leerstelle, die Oligos zu imitieren und werden leicht [15 ul BER Reaktionspuffer, 5 ul THF Leuchtfeuer und 5 ul Probenlysat] eingeschnitten sind. Selbstverständlich wird der genaue positive Kontrolle auf der gesamten experimentellen Design ab.
  5. Als ein Beispiel gemäß Tabelle 5 unten für die Platte Layout.
  6. Pipettieren Sie in optische Rohre oder Platten, während auf Eis oder gekühlte Stand zu Beginn Reaktion vor Signalerfassung zu minimieren.
  7. Pipettieren BER Reaktionspuffer erste in alle Vertiefungen.
  8. Die n Pipette Baken nach der Platte Layout in Brunnen und immer korrekte Pipettieren Lysate zuletzt in Bohrlöcher, um die Reaktion vor Einleitung Signalerfassung zu minimieren.
  9. Seal-Röhrchen oder Platten gründlich mischen und drehen mit einer Zentrifuge, um Lösungen für den Boden der Röhrchen oder Platten zu sammeln
  10. Legen Sie Platte in qRT-PCR-Maschine und beginnen Assay.
  11. Nach der Fertigstellung Rohdaten exportieren, vorzugsweise im Excel-Format. Für die StepOnePlus System nur die Mehrkomponenten-Daten benötigt werden. Dieser enthält alle Werte an den mehrere Lesevorgänge durch Färbung und gut sortiert.

4. Molecular Beacon Assay-Analyse

Wir verwendeten Microsoft Excel-Software, um diese Analysen und Berechnungen durchzuführen. Wir empfehlen Gründung Vorlagen und Makros, die eine einfache und schnelle Analyse und Grafik-Displays basierend auf Daten von Standard 96-Well-Format abgeleitet werden können.

4,1 Entfernung der Hintergrund

">
  • Wenn die Fluoreszenzantworten Werte aus den Mehrkomponenten-Daten zunächst die Daten nach und / Probe. Für die StepOnePlus System kann dies durch den Export der Daten "über Spalten" was in einer Excel-Datei mit den Zeilen der Anzeige einzelner mehrere liest erreicht werden an den verschiedenen Zyklen für die verschiedenen Brunnen in Spalten.
  • Für jeden einzelnen Molecular Beacon, subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenz-Werte in den negativen Kontrollen (20 uL BER Reaktionspuffer und 5 ul Leuchtfeuer) aus den Fluoreszenz-Werte bei jedem Zyklus in alle Vertiefungen mit diesem Molecular Beacon erkannt. Dies entfernt die Hintergrundfluoreszenz Änderungen nicht mit dem Lysat aus zukünftigen Analyse beteiligt werden.
  • 4,2 Fl (Tmax) Normalisierung

    Um die Variabilität in Pipettieren und Fluoreszenz-Detektion in verschiedenen Vertiefungen anzugehen, normalisieren wir die Daten auf die maximale Fluoreszenz-Werte (also korrelieren mit Leuchtfeuer-Eingang).

    1. Berechnen Sie die mittleren Werte der Fluoreszenz-Zyklen bei T max für den Einzelnen gut: Fl (T max) (Schritt 3.3aii).
    2. Berechnen Sie die Verhältnisse Fl (Zyklus x) / FI (T max) und mit 100 multiplizieren. Unter der Annahme, dass wahrscheinlich Fl (T max) auf die maximal mögliche Fluoreszenz-Wert entspricht bei voller eingeschnitten, stellen diese Daten normalisiert% kostenlos FAM (=% BER eingeschnittene Leuchtfeuer).
    3. Kombinieren der Proben in dreifacher Ausfertigung durch Mittelung der Daten (% frei FAM) der 3 Vertiefungen für jeden Zyklus (bis-Zyklus 180) und berechnet auf jeder Fehler.
    4. Berechnen mal 20 multiplizieren Sek. pro Zyklus.
    5. Da die Well-to-Well-Varianz in der Fluoreszenz-Detektion können erheblich sein, empfehlen wir, einen fluoreszierenden Farbstoff wie ROX dem Molecular Beacon Lager, die als Standard für neu zu justieren Fluoreszenz-Werte der einzelnen Brunnen dient hinzuzufügen. In diesem Fall würde der ROX-Farbstoff als interner Standard (passive Referenz) in jedem einzelnen verwendet werden. ROXAnregungs-und Emissionsspektren (Anregung - 588 nm, Emission 608 nm) unterscheidet sich von derjenigen der 6-FAM Farbstoff im Assay (Anregung - 495 nm, Emission - 520 nm) eingesetzt. Die ROX-Farbstoff würde ermöglichen Schritt der Normalisierung ähnlich den herkömmlichen RT-PCR-Verfahren, die Normalisierung der Well-to-Well-Differenzen, die durch Artefakte auftreten können ermöglicht. Diese können aus Pipettierungsfehler oder kann aus gut zu Vertiefung Änderung in der Fluoreszenz Detektionseffizienz stammen führen.

    4,3 Plot

    1. Plot normalisierte Fluoreszenz-Daten (% kostenlos FAM) gegen die Zeit (in Sekunden) in einem Streudiagramm mit entsprechenden Fehlern.
    2. Wir empfehlen die Analyse Reparatur Kinetik in mindestens drei verschiedenen nuklearen Lysat-Zubereitungen darstellt biologischen repliziert. Um die Varianz zu ermitteln, sollte zwischen den experimentellen Fehler aus den Mittelwerten der einzelnen Experiment berechnet angezeigt werden.
    3. Eine repräsentative Analyse von zwei Tumor Zelllysaten: LN428, ein GliomZelllinie, die mit nicht nachweisbare Mengen von Methyl-Purin-DNA-Glycosylase (MPG) und LN428/MPG, die gleiche Zelllinie für die erhöhte Expression von MPG entwickelt, beide Zell-Linien haben ein gleiches Niveau AP Endonuklease 1 (APE1) 1,2. Jedes wurden für APE1 Aktivität und MPG Aktivität unter Verwendung des BER THF Molecular Beacon (Abbildung 3) und die BER Hx Molecular Beacon (Abbildung 4), sondiert, wo THF = Tetrahydrofuran (ein Substrat für APE1) und Hx = Hypoxanthin (ein Substrat für MPG) . Hinweis: In 3 (THF Substrat), zeigen die Ergebnisse aus den Lysaten LN428/MPG eine niedrigere maximale absolute Fluoreszenz zu den Lysaten LN428 verglichen. Dies ist das Ergebnis einer unteren Bake Eingabewert wie unter Verwendung Tmax Werte (siehe 3.3a). Wenn diese niedrigeren Wert wurde verwendet, um die Ergebnisse zu normalisieren, so führt dies zu einer großen Änderung in der Darstellung. Dies illustriert sehr schön die Bedeutung der Normalisierung der Daten. Trägt man die absoluten Werte Fluoreszenz allein würde vorschlagen, die REPAIR-Raten zwischen LN428 und LN428/MPG Zellen sind unterschiedlich. Wenn jedoch die Daten normalisiert wird, um die Well-to-Variabilität gut betrachten, wird die APE1-vermittelten Reparatur Rate Unterschied gezeigt, dass minimal.

    5. Repräsentative Ergebnisse

    Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons (Abbildung 1). Einmal angelassen, schlagen wir vor der Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse (Tabelle 1) als Qualitäts-Beurteilung Ihrer Molecular Beacon (Abbildung 2). Nuclear Lysate können dann hergestellt, wobei die Pufferkomponenten, die in Tabelle 2 aufgeführt. Dialysieren des Lysats in 0,5 L vorgekühlte Dialyse-Puffer für 90 Minuten bei 4 ° C unter leichtem Rühren unter Verwendung eines Pierce Slide-A-Lyzer Dialyse Kassette gegen Dialysepuffer in Tabelle 3 aufgeführt. Sammeln Sie dieKernprotein dialysierte Lösung aus dem Dialysekassette mit einer Spritze. Verwenden eines anderen Dichtung als bisher um das Protein in der Dialysekassette Injektion verwendet. Die Konzentration der dialysierte Proteinlösung nach üblichen Verfahren. Beispiele der zu erwartenden nuklearen Lysat-Konzentrationen sind in Tabelle 4 gezeigt. Ausführen der Reaktion, wie oben angezeigt (Schritt 3.4), mit Hilfe der Platte Aufteilung wie in Tabelle 5 gezeigt. Eine repräsentative Analyse von zwei Tumor Zelllysaten: LN428, ein Gliom-Zelllinie mit nicht nachweisbare Mengen von Methyl-Purin-DNA-Glycosylase (MPG) und LN428/MPG, die gleiche Zelllinie für die erhöhte Expression von MPG entwickelt, beide Zell-Linien haben ein gleiches Niveau AP Endonuklease 1 (APE1) 1,2. Jedes wurden für APE1 Aktivität und MPG Aktivität unter Verwendung des BER THF Molecular Beacon (Abbildung 3) und die BER Hx Molecular Beacon (Abbildung 4), wo THF = Tetrahydrofuran (ein Substrat für APE1) und Hx = Hypoxanthin sondiert(Ein Substrat für MPG). Schließlich, unter Verwendung eines BER dU / A Molecular Beacon, dass Berichte über Uracil Glykosylase-Aktivität zeigen wir, dass Signalausgang oder Signalstärke ist maximal bei 10 ug des Proteins und verringert auf einen nicht nachweisbaren Niveau bei 0,62 g Protein (5).

    1
    Abbildung 1. Gesamtstruktur des BER Molecular Beacon. Dargestellt ist die Sequenz und der Gesamtaufbau der BER Molecular Beacons hier als einzelsträngige Molekül verwendet, nach dem Glühen wieder nach dem Schmelzen. Die fettgedruckten, kursiv Teil der Sequenz ist der Schaft (15 Basen) und der unterstrichene Teil der Sequenz ist die Schlaufe (13 Basen). FAM = 5'-Fluoreszenzfarbstoff 6-Carboxyfluorescein [über das 5'-Ende; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, Extinktionskoeffizient (260 nm): 20.960; Extinktionskoeffizient (bei der Absorption max): 75.000] und Dabcyl = die 3 'Quenchmittel Dab Zyl [auf der 3'-Ende; Abmax = 453 nm; Quenching Bereich = 425-520 nm] X = die Läsion (variiert je nach Fragestellung) und Y = die Basis gegenüber der Läsion (variiert je nach Fragestellung). .

    2
    Abbildung 2. Schmelzkurve. Eine repräsentative Schmelzkurve für die BER Molecular Beacon Control (A) gezeigt, und die BER Molecular Beacons mit der Tetrahydrofuran (THF)-Einheit (B) oder die Hypoxanthin (Hx)-Einheit (C). Oligonukleotid-Konzentrationen lagen zwischen 0 nM (dunkelblau), 8 nm (rot), 16 nm (grün), 32 nM (violett), 64 nm blau bis 128 nm (orange). Wie in Schritt 1.3 beschrieben, wurden die Oligonukleotide geglüht von 25 ° C bis 95 ° C in 0,5 ° C und die StepOnePlus ist so programmiert, FAM Fluoreszenz bei 0,5 ° C pro Intervall zu messen.

    Inhalt "> Abbildung 3
    Abbildung 3. Repräsentative Daten über die BER THF Molecular Beacon. AP-Endonuklease-Aktivität spezifisch für die Hydrolyse der abasischen Stelle analogen Tetrahydrofuran (THF) wurde in Lysaten von nuklearen der Kontroll-Zellinie (LN428) und der MPG Überexpression Zelllinie (LN428/MPG) gemessen . Jedes Lysat wurde analysiert, entweder mit dem BER Molecular Beacon Control (LN428, grün; LN428/MPG, lila) oder die BER THF Molecular Beacon (LN428, blau; LN428/MPG, rot). Die Ergebnisse werden wie ausgewiesen (a) die mittlere Fluoreszenz-Antwort-Einheiten und (B) die gleichen Daten normalisiert, um Beacon-Eingang, wie in Abschnitt 4 oben (THF = Tetrahydrofuran) beschrieben.

    Abbildung 4
    Abbildung 4. Repräsentative Daten über die BER Hx Molecular Beacon DNA-Glycosylase Aktivität spezifisch für die Entfernung des MPG Substrat hypoxanthine (Hx) wurde im nuklearen Lysaten von der Kontroll-Zelllinie (LN428) und der MPG Überexpression Zelllinie (LN428/MPG) gemessen. Jedes Lysat wurde analysiert, entweder mit dem BER Molecular Beacon Control (LN428, grün; LN428/MPG, lila) oder die BER Hx Molecular Beacon (LN428, blau; LN428/MPG, rot). Die Ergebnisse werden wie ausgewiesen (a) die mittlere Fluoreszenz-Antwort-Einheiten und (B) die gleichen Daten normalisiert, wie in Abschnitt 4 oben (Hx = Hypoxanthin) beschrieben.

    Abbildung 5
    Abbildung 5. Repräsentative Daten über die BER dU / A Molecular Beacon an verschiedenen Protein-Spiegel. DNA-Glycosylase (UNG) Aktivität, die spezifisch für die Entfernung von Uracil (dU / A) wurde in Lysaten von nuklearen T98G Zellen gemessen. Die T98G Lysats analysiert wurde entweder mit dem BER Molecular Beacon Control oder die BER dU / A Molecular Beacon, bei Protein-Spiegel von 10, 5, 2,5, 1,25 oder 0,62 ug, wie in der F angegebenBBILDUNG. Die Ergebnisse sind normalisierten Daten wie in Abschnitt 4 weiter oben beschrieben.

    Die Konzentration von Beacon (nM) 0 8 16 32 64 128
    Molecular Beacon-Arbeitslösung (200 nm) hinzugefügt (ul) 0 1 2 4 8 16
    BER Reaktionspuffer (w / o DVB-T) (ul) 25 24 23 21 17 9

    Tabelle 1. Layout einer Schmelzkurve Experiment.

    Insgesamt 1 L Volumen der Stammlösung benötigt Con. der Stammlösung Abschließende Con.
    HEPES-KOH 25 ml 1M pH 7,8 25 mm </ Td>
    KCl 75 ml 2 M 150 mM
    EDTA 1 ml 0,5 M pH 8,0 0,5 mM
    Glycerin 10 ml N / A 1%
    DTT (fügen Sie vor der Verwendung) 0,5 ml 1 M 0,5 mM
    H 2 O 888,5 ml N / A N / A

    Tabelle 2. BER Reaktionspuffer.

    Insgesamt 1 L Volumen der Stammlösung benötigt Con. der Stammlösung Abschließende Con.
    HEPES-KOH 50 ml 1M pH-Wert 7,5 50 mM
    KCl 50 ml 2 M 100 mM
    EDTA 1 ml 0,5 M pH 8,0 0,5 mM
    Glycerin 200 ml N / A 20%
    DTT (fügen Sie vor der Verwendung) 1 ml 1 M 1 mM
    H 2 O 698 ml N / A N / A

    Tabelle 3. Dialysepuffer.

    Cell Line Proteinkonzentration (ug / ul)
    LN428 5,34
    LN428/MPG 4,79

    Tabelle 4. Proteinbestimmung Ergebnisse.

    Negative Control 25 &mgr; BER Buffer (Background Control) 20 &mgr; l BER Buffer
    5μL Con Beacon
    NR Lysat
    (Test in dreifacher Ausfertigung) <br /> 15μL BER Buffer
    5μL Con Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Test in dreifacher Ausfertigung)
    15μL BER Buffer
    5μL Con Beacon
    5μL LN428/MPG Lysate
    Negative Control 25 &mgr; BER Buffer (Background Control) 20 &mgr; l BER Buffer
    5μL THF Beacon
    NR Lysat
    (Test in dreifacher Ausfertigung) 15μL BER Buffer
    5μL THF Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Test in dreifacher Ausfertigung) 15μL BER Buffer
    5μL THF Beacon
    5μL LN428/MPG Lysate
    Negative Control
    20 &mgr; l BER Buffer
    5μL Lysat
    (Background Control) 20 &mgr; l BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    NR Lysat
    (Test in dreifacher Ausfertigung)
    15μL BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Test in dreifacher Ausfertigung) 15μL BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428/MPG Lystillen
    Negative Control
    20 &mgr; l BER Buffer
    5μL Lysat

    Tabelle 5. Molecular Beacon Assay Set-up.

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    Discussion

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    Es gibt über 600 Zitate mit dem Begriff "Molecular Beacon" zur Detektion und Quantifizierung zahlreiche Moleküle und enzymatische Aktivitäten, einschließlich Helikaseaktivität 6, DNA-Polymerase-Aktivität 7,8, DNA-Ligase Aktivität 9, Telomerase-Aktivität 10, 11 DNA-Photolyase Aktivität und DNA / RNA-Hybride 12, unter vielen anderen. Neben der Verwendung von Molecular Beacons für die Messung der DNA-Reparatur oben genannten Aktivitäten, haben wir und andere die Nützlichkeit dieser Sonden für die Analyse von BER-Aktivität 1,2,13-15 gezeigt.

    Die Echtzeit-BER-Aktivitätstest beschreiben wir hier enthält einen einzigen modifizierten Base und erlaubt die quantitative Abschätzung der BER-Raten für verschiedene Läsionen oder Veränderungen in der Basis gegenüber der Läsion. Anträge können von den molekularen mechanistische Studien an Inhibitor-Bildschirme reichen. Wir haben gezeigt, BER Spezifität durch einen Vergleich Lysates von MPG exprimierenden Zellen mit nicht-exprimierenden Zellen und der Mangel an Aktivität in der Kontrollgruppe Beacons. Der Test ist sehr empfindlich, so dass die Erkennung von Defekten in der Expression des BER-Proteinen MPG 2 oder 1 und XRCC1 ist ausreichend, um geringfügige Änderungen in der DNA-Reparatur kinetischen Parameter und die Wirksamkeit der DNA-Reparatur-Inhibitoren [Manuskript in Vorbereitung] zu erkennen. Mehrere liest während der Reparaturzeit aktive Unterstützung berechneten kinetischen Raten und die Bedeutung in etwaiger Änderungen dieser kinetischen Raten. Die BER Molecular Beacon Assay eignet sich daher für High-Throughput-Studien zum Screening auf DNA-Reparatur-Enzym-Hemmer (Inhibitor-Bildschirme) oder für Studien über die Rolle der einzelnen nuklearen Komponenten. Die Analyse der nuklearen Lysaten ermöglicht die Beurteilung der DNA-Reparatur in vollem Rahmen der BER-Komplex daher auch der Darstellung indirekte Änderungen oder Einflüsse auf die BER-Maschinen (z. B. posttranslationale Modifikationen oder Mutationen).

    DieProtokoll, wie beschrieben, sollte zu hoch reproduzierbare und quantitative Ergebnisse. Allerdings gibt es einige Details zu beachten, um eine ordnungsgemäße Analyse zu gewährleisten: (1) Hintergrund-Werte von negativen Kontrollen zu hoch sein kann: Dies kann durch schlechte Lagerung oder Verarbeitung des Oligonukleotids. Hohe Hintergrundwerte in den Lysaten ohne Baken anzuzeigen Verwechslung Autofluoreszenz (dh durch Verschmutzung oder zelluläre Expression von exogenen fluoreszierende Proteine). Wenn die Expression eines fluoreszierenden Proteins unvermeidlich ist, kann die Anregung / Emissionsspektren für das Reporter-Farbstoff und fluoreszierendes Protein nicht überlappen, (2) Fl (Tmax) ist gering: DNA-Konzentration ist anders als angegeben. Überprüfen DNA-Konzentration durch Spektrophotometrie (OD 260nm) zum Beispiel, mit dem Nanodrop. Hohe DNA-Konzentration mit geringem Fl (Tmax) deutet auf eine unzureichende Belastung des FAM-Beacons. HPLC-Reinigung verhindert die Kontamination mit nicht modifizierten DNA (siehe oben), (3) Reparatur-Aktivität ist schlecht: wenn der FL (Tmax)-Werte beidie letzten Zyklen zeigen ausreichend Leuchtfeuer Eingangs-und Fluoreszenz-Detektion legt dies nahe, dass die Kernextrakt Vorbereitung gescheitert. Kernextrakt Qualität ist entscheidend. Selbst sehr kurze Belichtung der Proben auf Raumtemperatur vor der Analyse leitet Reparatur: Niedrige Temperaturen sollte während des gesamten Verfahrens einschließlich der langfristigen Lagerung bei -80 ° C und (4) Reparatur-Aktivität zu initiieren Kurven mit hohen Werten sichergestellt werden. Halten Sie jederzeit cool.

    Der empfindliche und quantitative BER Assay ist auch für die Analyse von gereinigten Proteinen, so dass Studien auf dem Substrat durch Verändern der Spezifität Molecular Beacons entsprechend. Schließlich ist der Test für die Analyse von Tumor-und Gewebe-Lysaten, die eine Gelegenheit bieten funktionellen DNA-Reparatur als Biomarker-Endpunkte des Ansprechens oder therapeutische Wirksamkeit zu messen, wie wir für die Bewertung Tumoren für PARP1 Inhibitor Potenzierung der Alkylierungsmittel Temozolomid 2 vorgeschlagen haben.

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    Disclosures

    RWS ist ein wissenschaftlicher Berater Trevigen, Inc. Die übrigen Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte.

    Acknowledgments

    Zu RWS Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Pittsburgh-Stiftung und der National Institutes of Health (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] unterstützt. Die Unterstützung für die UPCI Lentivirale Fazilität wurde zu RWS durch die Cancer Center Support Stipendium der National Institutes of Health [P30 CA047904]. Unterstützung wurde auch von der University of Pittsburgh Abteilung für Pharmakologie und Chemische Biologie an DS zur Verfügung gestellt. Unterstützung wurde auch durch ESTRO zu Lebenslauf zur Verfügung gestellt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
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    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
    4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
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    Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons
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    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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