Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Abstract

Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Substrat (işaret) bir 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) 5'end ve oligonükleotic'ten 3 'ucuna bir konjuge Dabcyl yarımına konjuge yarımı ile birlikte, tek bir baz ihtiva eden bir lezyonun deoxyoligonucleotide oluşur. BER moleküler işaret uzunluğu 43 bazlar ve sekansı kök 1,2 in halkası ve 15 baz çifti olarak 13 nükleotid ile birlikte bir kök döngülü yapısının oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır. Bu yapılandırmada, katlandığında 6-FAM yarımına Förster Rezonans enerji transferi (FRET) 3,4 yoluyla bir floresan olmayan bir şekilde Dabcyl ile söndürülmüştür. Lezyon 6-FAM parçası içeren kalan 5 baz oligonükleotid kök salınan şekilde aşağıdaki temel lezyon kaldırma ve iplik kesme konumlandırılmış. Bir serbest bırakınDNA onarım seviyesine orantılı floresans bir artış quencher (Dabcyl) sonuçları nd dekolmanı. Birden fazla toplayarak floresans değerlerinin okur, BER aktivitesinin gerçek zamanlı değerlendirmesi mümkündür. Standart kantitatif gerçek zamanlı PCR araçların kullanılması çok sayıda örnekleri arasında eşzamanlı analiz sağlar. Bu BER moleküler işaretlerinin tasarım, tek bir baz lezyonu olan, kinetik analizleri, BER ölçümü ve inhibitörü doğrulama mükellef ve doku ve tümör hücre lizatları DNA tamir aktivitesinin ölçümü için veya protein saflaştırılmış ile uyumludur. Bu moleküler işaretleri kullanarak tümör lizatları veya doku aspiratlarında BER faaliyet analizi fonksiyonel biyomarker ölçümü için geçerli olabilir. Dahası, bu niceliksel deneyi kullanılarak proteinleri ile saflaştırılmış BER aktivitesinin analizi BER inhibitörlerinin keşfi ve doğrulama için hızlı, yüksek verim bir yöntem sağlar.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Moleküler Beacon Tasarım

1.1 Tasarım ve moleküler işaret sipariş

Lütfen moleküler işaret tasarımı aşağıdaki düşünmek gerekir:

  1. Biz 43-mer DNA oligonükleotidler ile iyi sonuçlar var. GC içeriği>% 32 olmalıdır. 5 'ucunda bir taban G dahil değildir.
  2. Talep 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) 5 'ucu ve bir 3 gibi Dabcyl' modifikasyonuna konjugasyon.
  3. Lezyonun pozisyonu 5 'ucundan tabanı # 6 olmalıdır.
  4. Stem veya firkete dupleks uzunluğu 15 bp en az olmalıdır.
  5. Tavsiye loop uzunluğu 13 üsleri olduğunu.
  6. Işaret genel yapısının, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  7. Sırası ve lezyon tipi karar verildikten sonra, oligonükleotid en Oligonükleotid şirketlerden sipariş edilebilir. Biz IDT bizim oligonükleotidler sipariş ve oligonükleotidler HPLC saflaştırılmış ve provid olduğunu isteği, bir toz veya kuru bir biçimde ed.

1.2 için moleküler işaret Tavlama

  1. 40 uM'lik bir konsantre stok çözeltisi Molecular İşaret vermek; (0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) Oligo seyreltme tamponunda liyofilize DNA oligonükleotidler eritilir.
  2. BER reaksiyon tamponu (aşağıya bakın) kullanarak 40 uM Moleküler Beacon stok solüsyonu bir 200nm Moleküler Beacon çalışma çözeltisi hazırlayın. Steril bir siyah 1.5 ml tüp 200 nM Moleküler Beacon çalışma çözeltisi ekleyin.
  3. 3 dakika kaynar suda büyük bir behere 200 nM Moleküler Beacon çalışma çözeltisi içeren tüp inkübe edin.
  4. 3 dakika sonra, ısı kaynağından beher kaldırmak ve tavlama tanıtmak için bir gece suda Moleküler Beacons inkübe. Isı yalıtım soğutma işlemi yavaş üzerinde ve beher altında hem malzemelerini kullanın.
  5. Steril, siyah 1.5 ml tüpler içine tablet fenerleri, her tüp için 100 uL.
  6. -30 ° C'de deposunda

Lütfen moleküler işaret 1.3 Kalite değerlendirmesi

  1. BER moleküler işaretleri optimum erime sıcaklığı belirlemek ve ısıtıldığında her feneri floresan onaylamak için, ısıtmalı kadar floresan olmadığını onaylamak için bir erime eğrisi analizleri gerçekleştirin.
  2. Her bir işaret, 200 nM Moleküler Beacon çalışma çözüm ve BER reaksiyon tampon belirtilen hacim kazandırmak için, bir Hızlı Optik 96-plaka 6 kuyu (Applied Biosystems, Kedi # 4346906) için, Tablo 1'de gösterilen.
  3. Böyle StepOnePlus (Applied Biosystems) sistemi veya benzer erime eğrisi analizi sırasında FAM-boya uyarma izlemek ve bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanın.
  4. Programı, gerçek zamanlı PCR cihazı (StepOnePlus sistemi) erime eğrisi analizleri için küçük artışlarla artan sıcaklık fonksiyonu olarak FAM boya uyarma izlemek için. StepOnePlus sistemi FAM floresan ölçmek için programlanmıştır25 den NCE ve rampa ° C'de 95 ° C 0.5 ° C aralığı içinde. Tipik bir erime eğrisi şekil 2'de gösterilmektedir.
  5. Az veya hiç eşiğe 50 ° C altındaki sıcaklıklarda görünür olmalıdır Saf ve yüksek kalite işaretleri göstergesidir floresan bir üniforma ve dik bir artış olup olmadığını kontrol edin. 60 etrafında Tm değeri ° C ila 80 ° C elverişli olan ve her dilüsyonları için eşit olmalıdır.
  6. Bu analiz ile T max, maksimum floresans [Fl (max)] değerleri sıcaklık belirler. Beacon girişi (konsantrasyon) T m veya T max floresans değerlerin doğrusal orantılı olmalıdır. T max, Fl (max), az floresans değeri ° C'de en az 5 kat, 37 plan değerlerini aşmayacaktır.

2. Nükleer Lysate Hazırlık

2.1 Baz Eksizyon Onarımı reaksiyon tamponu 5 hazırlığı

  1. Listelenen tüm bileşenlerini ekleTablo 2 ve GKD 2 O. ile 900 mL tampon hacmi getirmek içinde
  2. Potasyum hidroksit 8.0 N (Sigma, Kedi # 17-8) kullanarak 7.8 pH ayarlayın.
  3. GKD 2 O. kullanan 1000 mL tampon hacmi getir
  4. 0,22 um bir filtreden, Nalgene 1 L filtresi (kedi # 167-0020) kullanılarak tampon filtre.
  5. BER reaksiyon tampon kullanmadan önce hemen ditiyotretol (DTT) ekleyin.

2.2 Hücre kültürü ve hücre izolasyonu

  1. Bu% 90-100 konfluent kadar kültür hücreleri önerilmektedir. Analizleri tam bir set (yaklaşık 5 x 10 7 hücre toplam) için yeterli nükleer lizatı elde 4-6 yemekler (150 mm) hücrelerin izole.
  2. Biyolojik Her analiz için çoğaltır elde etmek için 3 bağımsız hücre pelet 3 bağımsız kültürler hazırlamak için tavsiye edilir.
  3. Nükleer lizatları kolaylıkla NucBuster izolasyon prosedürü (Merck Bioscience Calbiochem Katalog # 71183-3) vasiyetini yazıp servetinin kullanılarak hazırlanırough herhangi bir nükleer izolasyon protokolü (bkz., Bölüm 2.3.) uygun olacaktır.

2.3 Nükleer lizat hazırlığı

  1. Önceden başlamadan, liyofilize edilmiş bir proteaz inhibitörü kokteyli (Calbiochem, Katalog # 539.131, 1 ayarlama) öncelikle bir 100X stok hazırlamak için 100 ul steril suda tekrar süspanse edilir. Uzun süreli saklama için -20 ° C'de kısım halinde hemen kullanın veya dondurma. Gerektiğinde her 10 7 Alınan hücreler için, 100x stok 1 ul hesaplayın.
  2. Ekstraksiyon işlemi sırasında tüm adımlar protein dengesini sağlamak için ° C buz üzerinde veya 4 yapılmalıdır.
  3. Etiket 15 ml Falcon tüp ve buz üzerinde bir yer.
  4. Hücrelerinden büyüme ortamı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez 7.5 ml yıkayın.
  5. Bir hücre hırsızı kullanarak plağı üzerindeki her çanağı ve sıyrık hücrelere soğuk PBS 5 ml ekleyin. Soğutulmuş 15 ml Falcon tüp hücreleri aktarın.
  6. 5 dakika düşük hızda (500x g, 4 ° C) santrifüj. Süpernatantıve karşılaştırma tarafından hematokrit tahmin ediyoruz. (En fazla 250 ul hematokrit tek bir 1.5 mL tüp işlenebilir)
  7. Başka 1 500x g dakika ve bir pipetle kalan PBS kaldırmak için santrifüj. 150 ul NucBuster Ekstraksiyon Reaktif 1 başına 50 ul hematokrit: hematokrit büyüklüğüne göre NucBuster Ekstraksiyon Reaktif 1 hücre pelletini. (Alternatif olarak, hücre pelletini kuru buz veya sıvı nitrojen ile hızlı dondurulmuş olması ve ° C hazır olana kadar devam etmek -80 muhafaza edebilirsiniz).
  8. Yeniden süspansiyon sonra, bir ön-soğutulmuş 1.5 mL tüpüne lizat transfer.
  9. Yüksek 5 dakika buz üzerinde inkübe hız, ve vorteks yüksek hızda tekrar 15 sn Vortex 15 sn.
  10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.000 g'de santrifüje
  11. Süpernatant sitoplazmik fraksiyonu içerir. Çıkarın ve -80 ° C'de saklayın veya atın.
  12. 1 yeniden süspanse 100X proteaz inhibitör kokteyli ile ul, 1 ve m oluşan bir karışım içerisinde pelet yeniden askıyau; 100 mM DTT ve 50 ul hematokrit başına 75 ul NucBuster Ekstraksiyon reaktifi 2 lt.
  13. Yüksek hızda 15 sn vorteks, yüksek hızda 5 dakika buz üzerinde inkübe edilir ve tekrar vorteks 15 san.
  14. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.000 g'de santrifüje Süpernatant nükleer protein içerir. Süpernatant toplayın ve bir sonraki adıma geçin.

2.4 Diyaliz, protein miktar ve aliquoting

  1. Diyaliz işlemi sırasında tüm adımlar özü kalitesini sağlamak için önceden soğutulmuş çözümleri, malzeme ve ekipman ile yapılmalıdır.
  2. Tablo 3'de ayrıntılı olarak diyaliz tampon (numune başına gerekli 1 L) hazırlayın. Önemli: Tampon (4 ° C) soğuk olmalıdır. Biz en az bir gün önce hazırlamak öneririz. Filtreli diyaliz tampon 4 saklanabilir ° C süresiz DTT eklenmiştir değil ise.
  3. Ön-chill bardak (örnek başına 2 1 L bardak), diyaliz tampon, diyaliz odaları, mikro-santrifüjtüpleri, şırıngalar ve iğneler.
  4. Sağ Kullanmadan önce - diyaliz tampon litre başına 1 ml 1 M DTT ekleyin.
  5. 4 de 90 dakika boyunca 0.5 L ön-soğutulmuş diyaliz tamponu içinde Basamak 2.3 'de hazırlanan lizat Dialyze ° C bir PIERCE Slide-A-Lyzer Diyaliz kaseti (7000 MW kesim ile 0,5-3 mL diyaliz kaset) kullanılarak karıştırılarak yumuşak.
  6. 0.5 L önceden soğutulmuş diyaliz tampon içeren ikinci bir behere diyaliz kaset aktarılır ve 4 de 90 dakika boyunca lizat dialyze ° C'de karıştırılarak yumuşak.
  7. Bir şırınga kullanılarak diyaliz kaset (Fisher, kedi # 309659) den diyalizlenmiş nükleer protein çözeltisi toplayın. Diyaliz kaset içine protein enjekte önceden kullanılan farklı bir conta kullanın. Özü yüksek protein konsantrasyonu nedeniyle kristalize olabilir unutmayın. Diyalizlenmiş nükleer protein çözeltisi çıkarmadan bulutlu görünümlü kristalleri içerir çalışın.
  8. Mikro-santrifüj tüpü, 20 ul her bir alikotu Örnek. Kuru buz ve stor Hızlı dondurma-80 adresine e ° C Kullanım kadar.
  9. Standart protokol kullanılarak diyalizlenmiş proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi. Beklenen Nükleer lisatı konsantrasyonlarını örnekleri, Tablo 4'te gösterilmiştir.
  10. Son olarak, lizatları kalite kontrolü için değerlendirilmelidir. Lizatlarının Değerlendirme deneme ile değişecektir. Daha önce açıklandığı gibi, rutin immunoblotting 1,2 aracılığı ile çeşitli BER proteinlerin ifade lizatları analiz.
  11. Diyaliz adım Mukayeseyi kolaylaştırmak için hücre çizgileri boyunca üniform bir reaksiyon çözeltisinin hale getirmek için kullanılır. Tuz çözeltileri ve reaksiyon koşulları gerekli çeşitli dilüsyonları bağlı olarak farklı hücre çizgileri ve preparatlar artık aynı olduğundan diyaliz adım atlama enzimatik oranları ve kinetik analiz etkileyebilir. Ancak, 5'inden mikrogram / ul lizatları kullanan ve yeterli reaksiyon tamponu ekleyerek diyaliz adım (veriler gösterilmemiştir) ihmal izin yok olduğunu gözlemledim. Inhibitörü çalışmaları thfarklı hücre lizatları arasında karşılaştırma gerekmez at, diyaliz gerekli olabilir. Belirtildiği gibi Ancak, diyaliz öneririz.

3. Moleküler Beacon Assay

3.1 Ekipman gereksinimleri

  1. Böyle StepOnePlus QRT-PCR veya karşılaştırılabilir, ya da gerçek zamanlı olarak FAM floresans algılamak ve ölçmek için yetenekli bir 96-plaka florimetre gibi bir kantitatif real-time PCR cihazı,. Not: Bu işlem işaretlerinin floresans değerleri okumak ve gerçek zamanlı olarak kayıt edebilmek herhangi bir makine için geçerlidir. Makine, bununla birlikte, kullanıcı veri analizi için ham floresans değerleri erişmesine olanak olmalıdır.
  2. Kullanılan optik QRT-PCR tüpleri ya da plakalar ile uyumlu santrifüjleyin.
  3. Microsoft Excel veri toplanan analiz etmek.

3.2 Tamponlar ve reaktifler

  1. Optik QRT-PCR tüpleri veya ilgili kapaklar ile plakalar.
  2. BER reaksiyon tamponu (bir bakınBove ve Tablo 2).
  3. Diyalizlenmiş nükleer protein olarak Adımlar 2.3 ve 2.4 olarak hazırlanan ve DTT içeren BER reaksiyon tamponu ile 2 mikrogram / uL protein seyreltilmiş ayıklar.
  4. Moleküler Fenerleri Moleküler Beacons çalışma çözeltisi (yukarıya bakınız) oluşturmak için BER reaksiyon tamponu ile 200 uM seyreltildi.

3.3 Test set-up (Tablo 5)

  1. Çalıştırma yöntemine değiştirilmesi gerekir, böylece QRT-PCR makinesi normal olarak bir fluorimeter olarak kullanılmamıştır.
    1. Programı ilk sahne ve 180 kez (veya daha fazla, onarım test tasarımına bağlı olarak) en az 20 sn lik bir çevrim zamanı (ölçümler için zaman noktaları) ile 37 ° C reaksiyon sıcaklığı ayarlayın. Siklusu boyunca veri toplamak için emin olun. Bu nedenle, makinenin 1 saat toplam veriler, her 20 saniye toplayacaktır.
    2. Özellikle işaret Tmax için sıcaklık, maksimum floresans ile sıcaklığı, rampalar olarak engellemek bir ikinci aşama oluşturmaAdım 1.3 (sizin moleküler işaret Kalite değerlendirmesi) 'da çıkarılmaktadır. Döngü süresi yine 15 döngü toplam 20 saniye olmalıdır. Bu işaret muhtemel maksimum floresans de 5 dakika için veriler, her 20 saniye toplayacaktır. Tmax de devir sırasında ölçülen floresan değerleri her iyi floresans değerleri (adım 4.2a) normalize etmek için kullanılmaktadır. Birkaç farklı işaretleri kullanıyorsanız da bu işaretlerinin Tmax için benzer tekrarlanan değerler sağlamak adımları eklemeyi unutmayın.
    3. 25 ul kadar reaksiyon hacmi ayarlanır.
  2. Applied Biosystems Kullanıcı yazılımı kullanılarak QRT-PCR makinesinde levhası tasarım-ayarlayın. Deneme türünü - Biz sadece ham floresans değerleri ile ilgileniyorsanız, bu nedenle "Standart Eğrisi" seçeneğini seçin.
  3. Plaka düzeni tamamlayın. Bir örnekte Tablo 5'te gösterilmiştir. Standart eğri olarak seçilen kuyulara bir şey eklemek yapmayın.

3.4 Run testi

  1. İthortant: Kullanım önceden soğutulmuş malzeme ve çözümleri. Çalışma ve algılama kadar serin tutun.
  2. Kullanılacak BER reaksiyon tampon DTT uygun miktarda ekleyin.
  3. BER reaksiyon tamponu (DTT) ile kullanılarak 2 ug / ml arasında derişimde protein çözeltisi ile seyreltilir.
  4. İlk deneyler için biz 10 diyalizlenmiş nükleer lizatın mikrogram başına iyi (iyi 5 uL /) ve substrat 1 pmole, 40 nM son konsantrasyonda moleküler işaret (5 uL / ​​kuyu) kullanmanızı öneririm. Farklı hücre lizatları veya işaret yüzeylerde yüksek veya düşük protein konsantrasyonları dikte olasıdır ancak biz sürekli, kaliteli ve hücre lizatı 10 mikrogram ile tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir.
    1. Her iyi tahlil bileşenleri 15 uL BER reaksiyon tamponu, 5 uL işaret ve 5 uL nükleer lizat vardır. Üç nüsha her beacon / lizat kombinasyonu çalıştırın.
    2. Birkaç negatif kontroller gibi 25 & gibi feneri olmadan numunelerin dahil, her işaret için gerekliMU; sadece BER reaksiyon tamponu ve 5 ul lizat ve lizat olmadan işaret 5 ul reaksiyon tampon BER 20 uL, 20 ul reaksiyon tampon BER L.
    3. Çeşitli kontrol örnekleri, her Nükleer lizat için gereklidir. Bu bir negatif kontrol [15 uL BER reaksiyon tamponu, 5 uL kontrol lambası (lezyon) ve 5 uL örnek lizat] içerir. Ayrıca bu tür oligos içeren abasic sitesini taklit ve kolayca [15 uL BER reaksiyon tamponu, 5 uL THF işaret ve 5 uL örnek lizat] insize edilir işaretleri içeren THF dahil edilmesi gibi deneysel pozitif kontrol dahil öneririz. Tabii ki, hassas bir pozitif kontrol genel deney tasarımı bağlı olacaktır.
  5. Bir örnek olarak, bord düzeni için aşağıdaki Tablo 5 izleyin.
  6. Sinyal algılama sonucu daha önce başlatılması en aza indirmek için buz veya soğutulmuş standında ise optik tüp ya da plaka haline pipetleyin.
  7. Bütün kuyulara ilk pipetleyin BER reaksiyon tamponu.
  8. n pipet işaretleri doğru kuyu ve her zaman pipet içine plaka düzeni göre sinyal algılama sonucu daha önce başlatılması en aza indirmek için kuyulara son lizatları.
  9. Seal tüpler veya plaka iyice karıştırın ve tüpler veya plakanın alt çözümler toplamak için bir santrifüj ile dönmeye
  10. QRT-PCR makineye plaka takın ve deney başlar.
  11. Tamamlanmasından sonra, Excel formatında, tercihen ham verileri. StepOnePlus sistemi için, sadece çok-bileşenli veri ihtiyaç vardır. Bu boya rengi ve iyi sıralaması okur birden tüm floresans değerlerini içerir.

4. Moleküler Beacon Test Analizi

Biz bu analizleri ve hesaplamaları gerçekleştirmek için Microsoft Excel yazılımı kullanılmaktadır. Biz standart 96-biçimleri elde edilen verilere dayalı olarak kolay ve hızlı analiz ve grafik ekranlar sağlayacak kurulması şablonlar ve makrolar öneririz.

Arka Plan 4.1 Kaldırma

">
  • Çok-bileşenli verilerden ham floresans değerleri kullanılarak, birinci yanı / numune tarafından veri düzenlemektedir. StepOnePlus sistemi için bu, bireysel birden gösteren satır içeren bir Excel dosyası ile sonuçlanan "sütun üzerinde" verilerini elde edilebilir sütunları farklı kuyuları için farklı devirlerde okur.
  • Her bireyin moleküler işaret için, moleküler işaret kullanan tüm kuyularda her bir döngüde floresans değerlerinden negatif kontrol (BER reaksiyon tamponu 20 uL ve fener 5 uL) tespit eşiğe değerleri çıkarmak. Bu gelecek analizi lizat ile ilişkili değildir eşiğe değişiklikleri kaldırır.
  • 4.2 Fl (Tmax) normalleştirme

    Pipetleme ve farklı kuyularda floresan algılama değişkenliği gidermek için, maksimum floresans değerleri (işaret girişi ile ilişkili olduğunu) veri normalleştirmek.

    1. Fl (T max) (adım 3.3aii): iyi birey için T max döngülerin ortalama floresans değerlerini hesaplayın.
    2. Oranları Fl (döngüsü x) / Fl (T max) hesaplayın ve 100 ile çarpın. Tam insize zaman Fl (T max) maksimum olası floresans değerine karşılık gelen olası varsayımı altında, bu normalize veri% ücretsiz FAM (=% BER kazılı beacon) temsil eder.
    3. Her devir için 3 kuyu verileri (% ücretsiz FAM) (döngüsü 180 kadar) ortalamasının üç nüsha örnekleri birleştirin ve her hataları hesaplar.
    4. Her devir için 20 sn çarparak kez hesaplayın.
    5. Floresans algılama hali-de varyans önemli olabilir bu yana, bireysel kuyuların yeniden ayarlamak floresans değerleri gibi standart hizmet moleküler işaret stok böyle ROX bir floresan boya eklemek için önerilir. Bu durumda, ROX boya ve her bir iç standart (pasif referans) olarak kullanılacaktır. ROXeksitasyon ve emisyon spektrumlarına (eksitasyon - 588 nm, 608 nm emisyonu) testi (- 495 nm, emisyon - 520 nm eksitasyon) çalışan 6-FAM boya olduğu ayrıdır. ROX boya eserler nedeniyle oluşabilecek hali-de farklılıklar normalleşme sağlar konvansiyonel RT-PCR işlemleri benzer bir normalleşme adımı sağlayacaktır. Bu hatalar pipetleme veya floresan algılama verimliliği iyi-to-iyi varyasyonu kaynaklı olabilir neden olabilir.

    4.3 Arsa

    1. Ilgili hataları olan bir scatter plot zaman (sn) karşı komplo normalize floresans verileri (% ücretsiz FAM).
    2. Biz biyolojik çoğaltır temsil eden en az üç farklı nükleer lizat hazırlıklarına onarım kinetik analiz öneririz. Varyans değerlendirmek için, her deney ortalamalarından hesaplanan arası deneysel hatalar görüntülenir.
    3. İki tümör hücre lizatlarının temsili bir analizi: LN428, bir gliomametil pürin DNA glikozilaz (MPG) ve LN428/MPG, MPG yükselmiş ifadesi için tasarlanmış aynı hücre hattı belirlenemeyen seviyeleri ile hücre hattı; her iki hücre AP endonükleaz 1 (APE1) 1,2 eşdeğer seviyeleri var. Her BER THF Molecular İşaret (Şekil 3) ve BER Hx Molecular İşaret (Şekil 4), kullanılarak APE1 aktivitesi ve MPG faaliyeti için probed yere THF = tetrahidrofuran (APE1 için bir substratı) ve HX = hipoksantin (MTG için bir substratı) . Not: LN428 lizatları ile karşılaştırıldığında, Şekil 3 (THF substrat) içinde, LN428/MPG lizatları elde edilen sonuçları daha düşük bir mutlak maksimum floresans göstermektedir. Bu gibi Tmaks değeri (3.3a bakınız) kullanılarak belirlenir daha düşük bir işaret değeri giriş sonucudur. Bu daha düşük bir değere sonuçlar normalize kullanıldığı zaman, bu plot büyük bir değişiklik ile sonuçlanır. Bu güzel bir şekilde verilerin normalize kadar önemli olduğunu göstermektedir. Tek başına mutlak floresans değerleri çiziliyor repa öneririmLN428 ve LN428/MPG hücreleri arasında ir oranları farklıdır. Bununla birlikte, veri hali-de değişkenliği dikkate normalize olduğunda, APE1-aracılı onarım hızı farkı az olduğu gösterilmiştir.

    5.. Temsilcisi Sonuçlar

    Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri (Şekil 1) kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Bir kez tavlanmış, sizin moleküler işaret bir kalite değerlendirme (Şekil 2) gibi bir erime eğrisi analizi (Tablo 1) performans göstermektedir. Nükleer lizatları sonra Tablo 2'de listelenmiş tampon bileşenleri kullanarak, hazırlanmış olabilir. 4 de 90 dakika boyunca 0.5 L ön-soğutulmuş diyaliz tamponu içinde lizat Dialyze ° C Tablo 3'de listelenmiştir diyaliz tamponu karşısında PIERCE Slide-A-Lyzer Diyaliz kaseti kullanılarak karıştırılarak yumuşak. Toplayınbir şırınga kullanılarak diyaliz kasetinden diyalizlenmiş nükleer protein çözüm. Diyaliz kaset içine protein enjekte önceden kullanılan farklı bir conta kullanın. Standart protokol kullanılarak diyalizlenmiş proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi. Beklenen Nükleer lisatı konsantrasyonlarını örnekleri, Tablo 4'te gösterilmiştir. Tablo 5'te gösterildiği gibi, plaka düzeni kullanılarak, (adım 3.4) yukarıda belirtildiği gibi reaksiyona çalıştırın. Her iki hücre AP eş düzeyde var; LN428, metil pürin DNA glikozilaz (MPG) ve LN428/MPG, MPG yükselmiş ifadesi için tasarlanmış aynı hücre hattı belirlenemeyen seviyeleri ile glioma hücre hattı: İki tümör hücre lizatları temsilcisi analizi endonükleazlar 1 (APE1) 1,2. Her bir THF = tetrahidrofuran (APE1 için bir substratı) ve HX = hipoksantin BER THF Molecular İşaret (Şekil 3) ve BER Hx Molecular İşaret (Şekil 4), kullanılarak APE1 aktivitesi ve MPG faaliyeti için probed edildi(MTG için bir substratı). Son olarak, urasil glikozilaz aktivite raporlarını, biz bu sinyal çıkışı veya sinyal gücünü protein 10μg maksimumdur ve protein 0.62 mikrogram (Şekil 5) saptanamaz seviyeye düşüyor gösteren bir BER dU / A Moleküler Beacon kullanırken.

    Şekil 1
    Şekil 1.. BER Moleküler İşaret genel yapısı. Gösterildiği tavlama sonra tekrar erime sonra, sırası ile tek damarlı bir molekül olarak burada kullanılan BER Molecular Beacons genel bir tasarımdır. Sekansının Koyu, Italics kısmı gövde (15 bazlar) ve altı çizili olarak sekansının kısmı loop (13 bazlar) 'dir. FAM = 5 'floresan boya 6-Carboxyfluorescein [5'end üzerine; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, Extinction Katsayısı (260 nm): 20.960; Extinction Katsayısı (absorbans max): 75.000] ve Dabcyl = 3 'söndürme ajanı Dab silindir [3'end üzerine; Abmax = 453 nm; Quenching Aralık = 425-520 nm] X = lezyon (araştırma sorusu bağlı olarak değişir) ve Y lezyon karşısında = tabanı (araştırma sorusu bağlı olarak değişir). .

    Şekil 2
    Şekil 2. Temsili bir erime eğrisi (A) BER Molecular İşaret Kontrol için gösterilmiştir. Eğri eritilir ve tetrahidrofuran (THF) yarımı (B) veya Hipoksantin (Hx) yarımı (C) ihtiva eden BER Molecular Beacons. Oligonükleotid konsantrasyonu 128 nM (turuncu) mavi 0 nM (koyu mavi), 8 nM (kırmızı), 16 nM (yeşil), 32 nM (mor), 64 nM arasında değişmektedir. Adım gibi 1.3 'de tarif, tavlanmış oligonükleotidler 25 ısıtıldı ° C 95 ° C 0.5 ° C aralıklarla ve StepOnePlus sistemi her 0.5 ° C aralığında FAM floresans ölçmek için programlanmıştır.

    içerik "> Şekil 3
    Şekil 3. BER THF Molecular İşaret kullanılarak temsili veri. Abasic sitesi analog tetrahidrofuran (THF) hidrolizi için spesifik AP endonükleazlar aktivitesi kontrolü hücre çizgisi (LN428) ve MPG aşırı ifadesi hücre çizgisi (LN428/MPG) nükleer lizatları ölçüldü . Veya BER THF Moleküler Beacon (mavi LN428; LN428/MPG, kırmızı); Her lizat ya BER Moleküler Beacon Kontrolü (LN428/MPG, mor LN428, yeşil) kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar olarak rapor edilmiştir (A) ortalama floresan tepkisi birimleri ve (B) yukarıdaki Bölüm 4 (THF = tetrahidrofuran) 'de anlatılan şekilde işaret girişine göre normalleştirilmiş aynı veri.

    Şekil 4
    Şekil 4. MPG substrat h çıkarılması için BER Hx Moleküler Beacon DNA glikozilaz aktivite özel kullanarak Temsilcisi veriypoxanthine (Hx) kontrolü hücre çizgisi (LN428) ve MPG aşırı ifadesi hücre çizgisi (LN428/MPG) nükleer lizatları ölçüldü. Veya BER Hx Moleküler Beacon (mavi LN428; LN428/MPG, kırmızı); Her lizat ya BER Moleküler Beacon Kontrolü (LN428/MPG, mor LN428, yeşil) kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar olarak rapor edilmiştir (A) ortalama floresan tepkisi birimleri ve (B) (Hx = hipoksantin) yukarıdaki Kısım 4'te tarif edildiği gibi normalize aynı veri.

    Şekil 5,
    Şekil 5. BER dU / farklı protein seviyelerinde bir Moleküler Beacon kullanırken veri Temsilcisi. Urasil kaldırılması (dU / A) için spesifik DNA glikozilaz (UNG) aktivitesi T98G hücrelerden nükleer lizatları ölçüldü. T98G lizatı 10 protein seviyeleri, 5, 2.5, 1.25 ve 0.62 g az, BER Moleküler İşaret Kontrol veya BER dU / A moleküler İşaret kullanılarak analiz edilmiştir olarak f belirtildiğiigure. Sonuçlar yukarıda Bölüm 4'te açıklandığı gibi normalleştirilmiş verilerdir.

    Beacon Konsantrasyon (nM) 0 8 16 32 64 128
    Moleküler Beacon çalışma çözeltisi (200nm) eklendi (uL) 0 1 2 4 8 16
    BER reaksiyon Buffer (w / o DTT) (uL) 25 24 23 21 17 9

    Tablo 1. Bir erime eğrisi deney Düzen.

    1 L Toplam Stok Çözüm hacmi ihtiyaç Con. Stok Çözüm Final Con.
    HEPES-KOH 25 mL 1M pH7.8 25 mM </ Td>
    KCl 75 mL 2 M 150 mM
    EDTA 1 mL 0,5 M pH 8.0 0.5 mM
    Gliserin 10 mL N / A % 1
    DTT (Kullanmadan önce ekleyin) 0,5 mL 1 M 0.5 mM
    H2O 888,5 mL N / A N / A

    Tablo 2. BER reaksiyon tamponu.

    1 L Toplam Stok Çözüm hacmi ihtiyaç Con. Stok Çözüm Final Con.
    HEPES-KOH 50 mL 1M pH7.5 50 mM
    KCl 50 mL 2 M 100 mM
    EDTA 1 mL 0,5 M pH 8.0 0.5 mM
    Gliserin 200 mL N / A % 20
    DTT (Kullanmadan önce ekleyin) 1 mL 1 M 1 mM
    H2O 698 ml N / A N / A

    Tablo 3. Diyaliz tampon.

    Hücre Hattı Protein Konsantrasyonu (mg / uL)
    LN428 5.34
    LN428/MPG 4.79

    Tablo 4. Protein Tayini sonuçları.

    Negatif Kontrol 25μL BER Tampon (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon
    5μL Con Beacon
    NO lizat
    (Üç kat Test) <br /> 15μL BER Tampon
    5μL Con Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Üç kopya halinde Test)
    15μL BER Tampon
    5μL Con Beacon
    5μL LN428/MPG Lysate
    Negatif Kontrol 25μL BER Tampon (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon
    5μL THF Beacon
    NO lizat
    (Üç kat Test) 15μL BER Tampon
    5μL THF Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Üç kat Test) 15μL BER Tampon
    5μL THF Beacon
    5μL LN428/MPG Lysate
    Negatif Kontrol
    20μL BER Tampon
    5μL lizat
    (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon
    5μL Hx Beacon
    NO lizat
    (Üç kopya halinde Test)
    15μL BER Tampon
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428 Lysate
    (Üç kat Test) 15μL BER Tampon
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428/MPG Lydoyurmak
    Negatif Kontrol
    20μL BER Tampon
    5μL lizat

    Tablo 5. Moleküler Beacon Test set-up.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Birçok molekül ve helikaz etkinliği 6, DNA polimeraz aktivitesi 7,8, DNA ligaz aktivitesi 9, telomeraz aktivitesi 10, DNA fotolizaz aktivitesi 11 ve DNA / dahil enzimatik faaliyetleri, tespit ve ölçülmesi için dönem 'moleküler feneri' kullanarak 600 alıntılar üzerinde bulunmaktadır diğerleri arasında melez 12, RNA. Yukarıda listelenen DNA onarım faaliyetlerinin ölçümü için moleküler işaretçileri kullanımı yanı sıra, bu ve diğer BER aktivitesi 1,2,13-15 analizi için, bu prob faydalı olduğunu göstermiştir.

    Biz burada tarif gerçek zamanlı BER aktivite tayini için tek bir modifiye tabanı içerir ve lezyonun karşısındaki tabanı farklı lezyonlar veya değişiklik için BER oranlarının nicel değerlendirmesi için olanak sağlar. Uygulamalar moleküler mekanik çalışmalardan inhibitörü ekranları arasında olabilir. Biz lysa karşılaştırarak BER özgünlük gösterdiMPG TES non-salgılayan hücrelerin ve kontrol sinyalleri aktivite eksikliği ile hücre ifade. Assay BER proteinleri MPG 2 ya XRCC1 1 ile ifade kusurların algılama sağlayan çok hassastır ve [lığa] küçük DNA tamir kinetik parametreleri değişiklikler ve DNA onarım inhibitörlerinin etkisini tespit etmek için yeterli olur. Çoklu kinetik oranları ve bu kinetik oranlarında herhangi bir değişikliğe önemi hesaplanan aktif onarım süresi boyunca destek okur. BER moleküler işaret testi bu nedenle DNA onarım enzimi inhibitörleri (inhibitörü ekranlar) veya tek tek nükleer bileşenlerinin rolü üzerinde çalışmaları için ekrana yüksek verimli çalışmalar için uygundur. Nükleer lizatlarının analizi BER kompleksinin tam bağlamında DNA tamir değerlendirmenin bu nedenle, aynı zamanda BER makine (örneğin, post-çevirisi tadilatları ya da mutasyonları) üzerinde dolaylı bir değişiklik veya etkiler gösteren sağlar.

    protokolü, tarif edildiği gibi, yüksek tekrarlanabilir ve niceliksel sonuçların elde edilmelidir. Ancak, doğru analiz sağlamak için düşünmeye pek çok ayrıntı vardır: (1) negatif kontrollerin Arkaplan değerleri çok yüksek olabilir: Bu kötü depolama veya Oligonükleotid imalatı bağlı olabilir. Işaretleri olmadan lizatları Yüksek arka plan değerleri karıştırıcı otomatik floresans (kirlenme veya eksojen floresan proteinlerin hücresel ifadesi ile yani) gösterir. Bir floresan proteini ifade kaçınılmaz ise, muhabir boya ve floresan protein için uyarma / emisyon spektrumları üst üste olmayabilir, (2) Fl (Tmax) düşüktür: DNA konsantrasyonu verilen farklıdır. Nanodrop kullanarak, örneğin spektrofotometri ile DNA konsantrasyonu (OD 260 nm) kontrol edin. Düşük Fl (Tmax) Yüksek DNA konsantrasyonu işaretleri üzerinde yetersiz bir FAM yükleme gösterir. HPLC arıtma değiştirilmemiş DNA (yukarıya bakınız) kirlenmesini önler, (3) Tamir aktivite kötü: Fl (Tmax) değerleri iseson devir yeterli işaret giriş ve floresan tespiti gösterir, bu nükleer özü hazırlanması başarısız olduğunu öne sürebilir. Nükleer özü kalitesi çok önemlidir. Analizden önce oda sıcaklığına örneklerin bile çok kısa maruz onarım başlatır: düşük sıcaklıklarda, uzun süreli depolama -80 ° C ve (4) tamir aktivitesi eğrileri yüksek değerler de dahil olmak üzere başlatabilir işlem boyunca sağlanmalıdır. Her zaman serin tutun.

    Bu son derece hassas ve kantitatif BER testi de buna göre moleküler işaretleri değiştirerek substrat özgünlüğü üzerinde çalışmaların yapılacağı, saflaştırılmış protein analizi için geçerlidir. Son olarak, tahlil biz alkilleyici ajan temozolomide 2 PARP1 inhibitörü potansiyasyonu için tümörlerin değerlendirilmesinde iddia ettikleri gibi, yanıt veya tedavi edici biyolojik olarak işlevsel bir DNA tamir uç noktaları ölçmek için bir fırsat sağlayarak, tümör ve doku lizatlarının analizi için geçerlidir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    RWS Trevigen, Inc yazarların kalanı Çıkar çatışması olduğunu açıklamak üzere bir Bilimsel danışmanıdır.

    Acknowledgments

    RWS Bu çalışma Pittsburgh Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] hibe ile desteklenmiştir. UPCI lentiviral Tesis desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri Kanser Merkezi Destek Hibe tarafından RWS sağlanmıştır [P30 CA047904]. Destek aynı zamanda Pittsburgh Üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı & DS Kimya Biyoloji tarafından sağlandı. Destek de CV Estro tarafından sağlandı.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
    2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
    4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
    5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
    6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
    7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
    8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
    9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
    10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
    11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
    12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
    13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
    14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). (2009).
    15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
    Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter