Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Imaging Gliom Inledande doi: 10.3791/4201 Published: November 20, 2012
* These authors contributed equally

Summary

Genom att kombinera en polerad och förstärkt tunna skallen (portar) kraniell fönster och glioblastom (GBM) cellinjektion kan vi konstatera gliom initiering och tillväxt injicerade GBM celler i hjärnan på en levande mus i längdriktningen.

Abstract

Gliom är en av de mest dödliga formerna av human cancer. Den mest effektiva gliom behandling hittills-kirurgi följt av strålbehandling, erbjuder patienter endast blygsamma fördelar, eftersom de flesta patienter inte överlever mer än fem år efter diagnos på grund av gliom återfall 1,2. Upptäckten av cancer stamceller i humana hjärntumörer har förutsättningar för att ha en enorm inverkan på utvecklingen av nya terapeutiska strategier för gliom 3. Cancer stamceller definieras av sin förmåga både att själv förnya och att differentiera, och tros vara de enda celler i en tumör som har kapacitet att initiera nya tumörer 4. Gliom återfall efter strålbehandling tros härröra från motstånd gliom stamceller (GSCs) till terapi 5-10. In vivo är GSCs visas att bosätta sig i en perivaskulär nisch som är viktig för att upprätthålla sina stamceller-liknande egenskaper 11-14 . Centralt för organisationensering av generalsekretariatets nisch är vaskulära endotelceller 12. Befintlig data tyder på att GSCs och deras interaktion med vaskulära endotelceller är viktiga för tumörutveckling och identifiera GSCs och deras samverkan med endotelceller som viktiga terapeutiska mål för gliom. Förekomsten av GSCs bestäms experimentellt genom deras förmåga att initiera nya tumörer på ortotop transplantation 15. Detta uppnås typiskt genom att injicera ett visst antal GBM celler isolerade från humana tumörer i hjärnorna av allvarligt nedsatt immunförsvar möss, eller av mus GBM celler in i hjärnan hos kongena värdmöss. Analyser för tumörtillväxt utförs sedan efter tillräcklig tid för att tillåta GSCs bland injicerade GBM celler för att ge upphov till nya tumörer, typiskt flera veckor eller månader. Därför tillåter befintliga analyserna inte granskning av viktiga patologiska processen av tumör initiering från enskilda GSCs in vivo. Följaktligen viktigt insights i de specifika roller GSCs och deras interaktion med vaskulära endotelceller i de tidiga stadierna av tumör initiering saknas. Sådana insikter är avgörande för att utveckla nya terapeutiska strategier för gliom, och kommer att ha stora konsekvenser för att förebygga gliom återfall hos patienter. Här har vi anpassat portarna kranial fönster förfarande 16 och in vivo två-foton mikroskopi för att möjliggöra visualisering av tumörens initiering från injicerade GBM celler i hjärnan på en levande mus. Vår teknik kommer att bana väg för framtida insatser för att belysa de viktigaste signaleringsmekanismer mellan GSCs och vaskulära endotelceller under gliom initiering.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Protokoll

  1. Söva musen med ketamin och xylazin i en dos av 0,1 mg ketamin och 0,01 mg xylazin per 1 g kroppsvikt. Karprofen (0,005 mg per 1 g kroppsvikt) användes för analgesi och administreras preoperativt.
  2. Alla kirurgiska verktyg, inklusive den dentala borret, är ångsteriliseras i en autoklav. Om satsvisa operationer ska utföras, måste spetsarna hos kirurgiska instrument omsteriliseras med en glaspärla steriliseringsanordning (skön Science Tools FST 250) före varje efterföljande operation.
  3. När musen har nått en kirurgisk plan av anestesi, bedömt genom avsaknaden av ett svar på en tå nypa, placeras den på en bomullstuss som sedan placeras på en uppvärmd dyna för att upprätthålla en kroppstemperatur av ca 37 ° C. Anestesidjupet övervakas ofta under operationen.
  4. Päls avlägsnas från rygg huvudet i ett grovt triangulärt område ~ 3 mm kaudalt om näsborrarna och sträcker kaudalt till cervical kotor. Oftalmisk salva appliceras på ögonen för att skydda dem från uttorkning och irritation.
  5. Musen placeras i ventrala recumbancy och huden desinficerades med kirurgisk jod, 70% etanol, och sterila kompresser. En 0,8 x 1,0 cm flik av hud som täcker rygg aspekt av frontal-och parietala skallben bort med fina sax.
  6. En topisk smärtstillande, 0,5% lidokain, appliceras lokalt till periosteum och de exponerade vävnaderna vid periferin av såret. Periosteum avlägsnas genom att försiktigt skrapa skallen med ett skalpellblad, vilket kommer att hjälpa cyanoakrylatlim att vidhäfta till benet.
  7. Den kortikala intresseområde beskrivs på skallen med en markör. Området av intresse bör inte placeras över linjer skalle sutur för att undvika skador på underliggande stora fartyg.
  8. Ett tunt skikt av cyanoakrylat-adhesiv appliceras på sårkanterna, för att förhindra läckage av serosanguinous vätska, samt till skallen förutom iområdet av intresse.
  9. Ljusaktiverat dentalcement används i vår protokoll för tätning av skallen. Före applicering av tandcement, all exponerad skalle utom området avsett för gallring behandlas med primers och därefter med bindemedlet från ljusaktiverat tandcement kit. När bindemedlet torkas, den ljusaktiverat dentalcement används för att täcka skallen. För att stabilisera huvudet av musen för efterföljande kirurgi och bildhantering, är en steril # 00-90 muttern inbäddat i tandcement på ett avstånd från det område som ska gallras. Användningen av ljusaktiverat tandcement tillåter oss att förbereda skallen utan att behöva rusa för att slutföra hela förfarandet. När tandcement preparatet på skallen är fullbordad, är den dentala cement härdas med synligt ljus.
  10. Efter tandcement härdas, är en huvudstycke hållare från stereotaktisk anordning monterad på muttern på musen huvudet med en # 00-90 skruv.
  11. En drop av rumstemperatur, är 0,9% steril saltlösning appliceras på skallen område som ska förtunnas. Med hjälp av ett stereomikroskop är en snabb mikro-borr som används för att förtunna en cirkulär yta av skallen (typiskt ~ 4-5 mm i diameter) över området av intresse. Borrning och tillämpningen av saltlösning till den borrade området utförs intermittent under gallring förfarandet att undvika termisk skada på underliggande cerebrala vävnaden. Saltlösning absorberar värme och hjälper också mjuka benet.
  12. Musen skalle innefattar två tunna skikt av kompakt ben, sandwiching ett tjockt skikt av spongiösa benet. Det yttre skiktet av kompakt ben och de flesta av det spongiösa benet avlägsnas med borren.
  13. Efter majoriteten av det spongiösa benet avlägsnas, kan de återstående hålrummen inom det spongiösa benet ses under ett dissektionsmikroskop, indikerar att borrning närmar sig inre kompakt ben skikt. I detta skede bör skalle tjocklek fortfarande mer än 50 um. Skalle gallring börfortsatte försiktigt för att erhålla en mycket tunn (~ 20 | im) och jämn beredning.
  14. När önskad tjocklek skallen uppnås (~ 20 nm) är skallen 1:a poleras med en skräddarsydd silikon piska med diamantpasta (6-15 nm) under ca 10 minuter. Diamanten-klistra polering tjänar två syften. Först, tunnar det ytterligare skallen utan att applicera tryck på den förtunnade skallen, därigenom undvika oavsiktlig skada på den underliggande hjärnvävnad. Det andra fungerar den som ett första polering steg för förtunnade skallen innan den finkorniga tennoxid används för ytterligare skalle polering.
  15. Efter diamant-pasta polering, är den uttunnade skallen poleras med tennoxid för cirka 10 minuter. När skallen är polerad, är tennoxid spolas bort med koksaltlösning tills tunnas skallen verkar ren.
  16. Vid detta steg, om den kraniala fönstret skall användas för längsgående bildåtergivning in vivo, är det rengjorda tunna skallen område torkas. En liten droppe av klarcyanoakrylatlim appliceras täta den kraniala fönstret. Skiktet av cyanoakrylatlim mellan den förtunnade skallen och täckglaset bör vara så tunn som möjligt.
  17. Om en injektion skall utföras efter skapandet av en portar kranial fönster, i detta steg är en 26-gauge sprutnål används för att skapa en liten öppning på ena sidan av den polerade tunna skalle fönstret. Denna öppning används för GBM cellinjektion.
  18. En steril glaspipett med en spets öppning approximativt 50 um i diameter dras med användning av en pipett avdragare. Denna pipett kommer att användas för GBM cellinjektion, och laddas på en mikromanipulator. Pipetten laddas på en 30-graders vinkel så att GBM cellen injektionsstället kommer att vara borta från den slutliga avbildning platsen. Den pipettspetsen avlägsnades under en dissektion mikroskop. GBM cellsuspensionen är frontmatade in i pipetten med sugning med användning av en sprutpump.
  19. När injektionen pipetten är laddad med GBM celler, musen flyttas tillbaka under the mikroskop. Den injektionspipetten sänks mot den lilla öppningen i den kraniala fönstret och slutligen in i hjärnan genom öppningen med hjälp av en mikromanipulator. 1 pl av en GBM cellsuspension sprutas in i hjärnan 100-200 um från hjärnans yta (hastighet: 0,1 pl / min, varaktighet: 10 minuter).
  20. Skallen torkas, är en liten droppe av klar cyanoakrylatlim appliceras på torkade skallen, och en bit av 3-mm storlek # 1 täckglas är fäst till den tunna och polerade skalle område. Utrymmet mellan täckglaset och intilliggande dentalcement tätas med cyanoakrylatlim.
  21. Efter operation är mus injiceras subkutant med 1 ml varm steril saltlösning och försedd med extra värme för att upprätthålla kroppstemperaturen tills helt återhämtat sig från anestesin.
  22. För avbildning, möss bedövades med ketamin och xylazin i en dos av 0,1 mg ketamin och 0,01 mg xylazin per 1 g kroppsvikt. Möss är immobiliserade med en anpassad stereotaktisk ramunder mikroskop. Om repetitiva in vivo imaging utförs på daglig basis, kommer isofluoran vara ett bättre alternativ, som möss visar tecken på beroende med upprepad användning av ketamin.

2. Representativa resultat

En framgångsrik portar kranial fönster kirurgi tillåter den kraniala fönstret förbli klart under veckor till månader. Figur 1 visar vaskulaturen under en portar kraniell fönster som visualiseras med bakåtspritt ljus. Dessa vaskulaturen bilder användes som landmärken för att lokalisera samma hjärnområden för upprepad avbildning. För att visualisera både kärlsystemet endotelceller och GBM celler, korsade vi B6.Cg-Tg (Tek-CRE) 1Ywa / J mus, vilka etiketter vaskulära endotelceller med B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato ) Hze / J mus och genererade möss med vaskulära endotelceller märkta med röda fluorescerande proteinet tdTomato. Vi utförde därefter portarna kraniotomi förfarandet på dessa mice, och injicerades GFP-märkta GBM celler i deras hjärnor genom en liten öppning på sidan av en kranial fönster. Vi utförde därefter in vivo två-foton avbildning längdriktningen på de injicerade möss. Lasern excitationsvåglängden var inställd på 910 nm, vilket resulterade i excitering av både GFP och tdTomato. Två-foton avbildning utfördes på en specialbyggd två-photon laser-scanning mikroskop med två detektorer för samtidig grön / röd fluorescens detektionsförmågan. Visar en in vivo exempel av gliom initiering från injicerade GBM celler nära kärlsystemet Figur 2. Portarna kraniell fönster är också ett utmärkt val för kronisk tidsförlopp in vivo imaging. Figur 3 visar GFAP färgning av kortikala delar från en mus utan portar kirurgi, en mus 7 dagar efter portar kirurgi, och en mus 7 dagar efter HAMNAR kirurgi och saltlösning injektion. Det är uppenbart från de bilder som musen utan kirurgi och mus med porTS kirurgi har inte glios, medan följande saltlösning injektion glios observeras i hjärnvävnaden av musen, beroende på pipettera penetration och saltlösning injektion i hjärnan. Detta resultat visar att glios inte sker under Portar kraniala fönstret, tillhandahålla oberoende bekräftelse på att de hamnar kranial fönster beskrivs här inte leder till glios som vanligtvis förknippas med en "öppen skalle" kronisk kranial fönster. Figur 4 visar högupplösta avbildning av Dendritutskotten från samma mus på dagen för operationen (dag 0) och 32 dagar efter portarna fönstret skapas (Dag 32), som visar att de hamnar fönstret är också ett utmärkt val för hög upplösning in vivo imaging.

Figur 1
Figur 1. Visualisering av kärlsystemet under en förtunnad polerad och förstärkt skallen kraniala fönster med återspridda ljuset. Days representerar t Han antal dagar efter operationen, bilder togs med början på dagen för operationen omedelbart efter avslutad GBM cellinjektion. Skala bar:. 0,5 mm Klicka här för att se större bild .

Figur 2
Figur 2. Visualisering av injicerade GBM celler och vaskulaturen in vivo. Möss som bär både Tek-Cre och ROSA26 CAG-tdTomato användes för GBM celler injektion. Vaskulära endotelceller märktes med tdTomato (röd), och GBM celler märktes med GFP (grönt). Bilder förvärvades start 24 timmar efter GBM cellinjektion. Totalt 10-12 intilliggande synfält togs och sattes ihop intill varandra, med de injicerade identifierade GBM celler i mitten av det totala fältet, för att producera de slutliga bilderna. Dagar representerar antalet dagar efter operationen. Skala bar: 100 nm.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se större bild.

Figur 3
Figur 3. Glios inte inträffar följande portar kranial fönster kirurgi. Övre paneler: mushjärna koronalt sektion under lägre förstoring. Vänster panel: en mus utan kraniell fönster kirurgi, ingen GFAP aktivering observeras i hjärnvävnaden. Mitten panelen: en mus med portar kraniell fönster genereras på höger sida av hjärnan, ingen GFAP aktivering observeras i hjärnvävnaden. Höger panel: en mus med portar kraniell fönster och saltlösning injektion från sidan av portarna fönstret. GFAP aktivering observeras på sidan av hamnarna fönstret, men inte på sidan av intakt hjärnvävnad. Skala bar: 1 mm. Lägre panel: högre effekt bilder av hjärnan vävnader i områden som anges i den vita rutan för övre panelen bilder. Skala bar: 100 nm.

Figur 4
Figur 4. Högupplöst avbildning av Dendritutskotten från Thy-1 YFPH möss. Bilder förvärvades på dagen för hamnarna kirurgi och 32 dagar efter HAMNAR operation. Det framgår av de bilder som de flesta ryggar presenterar på dag 0 syns tydligt 32 dagar följande portar operation. Skala bar: 2 pm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nyckeln till en lyckad portar kraniell fönster är gallring och polering. Även om den ursprungliga gallring kan utföras snabbt, bör åtgärder vidtas för att säkerställa homogen förtunning av skallen över ett stort område. Vi tillämpar typiskt ett tunt skikt av saltlösning till skallen, och sedan tunn skallen ett pass vid en tidpunkt, så att saltlösningen avdunstar strax efter Microdrill har passerat över skallen gång. Det ger oss möjlighet att sakta men homogent ytterligare tunna skallen. En stadig hand under mikroskop är också viktigt. När skalle-gallring närmar avsedd tjocklek, använder vi normalt diamant klistra för att polera den uttunnade skallen i 10-15 min, med efterföljande polering med tennoxid. Vi finner att polering den förtunnade skallen först med diamantpasta ger ett bättre polering resultat i allmänhet, och också tillåter oss att ytterligare tunna ett stort område av skallen område utan att applicera mycket tryck på den förtunnade skallen området.

Vi valde portar spanial fönster snarare än andra vanliga kraniala fönster, som "öppna skallen" fönster och "tunnas skallen" fönstret, av följande skäl: Med det öppna skallen fönstret blir kraniala fönstret vanligtvis grumlig strax efter skapelsen och sedan rensar upp på egen hand under de första två veckorna, vilket kräver en väntetid på cirka två veckor innan avbildning experiment kan utföras. Detta två veckor väntetid skulle förhindra visualisering av gliom initiering under de första två veckorna efter GBM cellinjektion. Den uttunnade skallen kranial fönster kräver repetitiva gallring före varje avbildning session, vilket gör det olämpligt för GBM cellinjektion och visualisering av gliom initiering på en daglig basis. Däremot tillåter portarna fönstret oss att utföra GBM cellinjektion från sidan av fönstret, vilket minimerar skador på hjärnvävnaden och även tillåter utförande av högupplöst avbildning omedelbart efter skapandet av fönstret. InfFörnyelsen av gliom initiering kan samlas under de första veckorna efter GBM cellinjektion, vilket är en viktig fördel jämfört med den öppna skallen tekniken för denna typ av studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant och The Maine cancerfonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate Thermo Sci Hyclone SH3026101
B-27 Serum Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
GlutaMax-1 Supplement Invitrogen 35050061
Penicillin-Streptomycin Solution Thermo Sci Hyclone SV30010
Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium eBioscience 00-4555-56
T25 flasks-vent cap green Sarstedt Ltd 83.1810.502
70% alcohol JAX LAHS
10% povidone-iodine topical solution JAX LAHS
Ketamine HCl Butler Animal Health Supply NDC# 11695-0550-1
Xylazine Akorn, Inc. NADA# 139-236
Carprofen JAX LAHS
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
0.5% Lidocaine HCl REGENT, Inc. NDC 0517-0625-25
Cyanoacrylate glue Henkel Corp 46551
Sterile Swabs Fisher Scientific 23-400-114
Diamond paste Widget Supply BBE60
Tin oxide LORTONE, Inc. 591-038
Liner Bond 2V KURARAY Medical Inc. 1921-KA
Clearfil AP-X KURARAY Medical Inc. 1721-KA
Saline JAX LAHS
Cover glass Warner Instruments 64-0720
Hex Nut Small Parts, Inc. HNX-0090-C
Syringe Pump Syringepump.com NE-1000
Two-Photon imaging system Custom built (Any commercial system would work)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
  6. Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
  7. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
  8. Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
  9. Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
  10. Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
  11. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
  13. Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
  14. Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
  15. Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
  16. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
Imaging Gliom Inledande<em&gt; In Vivo</em&gt; Genom en polerad och förstärkt Thin-skalle Kranial fönster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Lapierre, A., Roy, B., Lim, M., Zhu, J., Wang, W., Sampson, S. B., Yun, K., Lyons, B., Li, Y., Lin, D. T. Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window. J. Vis. Exp. (69), e4201, doi:10.3791/4201 (2012).More

Zhang, L., Lapierre, A., Roy, B., Lim, M., Zhu, J., Wang, W., Sampson, S. B., Yun, K., Lyons, B., Li, Y., Lin, D. T. Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window. J. Vis. Exp. (69), e4201, doi:10.3791/4201 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter