Summary
Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.
Abstract
Glioom is een van de meest dodelijke kankersoorten. De meest effectieve glioom therapie-to-date-operatie gevolgd door bestraling-biedt patiënten slechts bescheiden voordelen, omdat de meeste patiënten niet langer dan vijf jaar te overleven na de diagnose als gevolg van glioom terugval 1,2. De ontdekking van kanker stamcellen in de menselijke hersentumoren houdt belofte voor het hebben van een enorme impact op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor glioom 3. Kankerstamcellen worden gedefinieerd door hun vermogen zowel zichzelf te vernieuwen en te differentiëren, en men denkt dat de enige cellen in een tumor die het vermogen om te leiden nieuwe tumoren 4 hebben. Glioom terugval na radiotherapie wordt gedacht afkomstig te zijn van resistentie van glioma stamcellen (GSC) de behandeling 5-10. In vivo zijn GSC getoond in een perivasculaire niche die belangrijk verblijven voor het on stamcelachtige eigenschappen 11-14 . Centraal in de organisatiesatie van het SGR niche zijn vasculaire endotheliale cellen 12. Bestaande gegevens wijzen erop dat GSC en hun interactie met de vasculaire endotheliale cellen van belang zijn voor de ontwikkeling van tumoren, en identificeren GSC en hun interactie met endotheliale cellen als belangrijke therapeutische doelen voor glioom. De aanwezigheid van GSC wordt experimenteel bepaald door hun vermogen om nieuwe tumoren te starten op orthotope transplantatie 15. Dit wordt meestal bereikt door het injecteren van een bepaald aantal GBM cellen geïsoleerd uit menselijke tumoren in de hersenen van ernstig immuno-deficiënte muizen of van muizen GBM cellen in de hersenen van congene ontvangende muizen. Assays voor tumorgroei Daarna volgen na voldoende tijd om GSC tussen de geïnjecteerde cellen GBM tot nieuwe tumoren, meestal enkele weken of maanden. Vandaar dat er bestaande tests niet toe dat het onderzoek van de belangrijke pathologische proces van tumor initiatie van enkele GSC in vivo. Derhalve essentieel insights in de specifieke rollen van GSC en hun interactie met de vasculaire endotheelcellen in de vroege stadia van tumorinitiatie ontbreken. Dergelijke inzichten zijn van cruciaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor glioom, en zal grote implicaties hebben voor het voorkomen van glioom terugval bij patiënten. Hier hebben wij de poorten craniale venster procedure 16 en in vivo twee-foton microscopie voor visualisatie van tumor initiatie van geïnjecteerde GBM cellen in de hersenen van een levende muis mogelijk te maken. Onze techniek zal de weg effenen voor toekomstige inspanningen om de belangrijkste signaleringsmechanismen tussen GSC en vasculaire endotheliale cellen toe te lichten tijdens glioom initiatie.
Protocol
1. Protocol
- Verdoven de muis met ketamine en xylazine in een dosis van 0,1 mg en 0,01 mg ketamine van xylazine per 1 g lichaamsgewicht. Carprofen (0,005 mg per 1 g lichaamsgewicht) wordt gebruikt voor analgesie en preoperatief toegediend.
- Alle chirurgische instrumenten, waaronder de tandheelkundige boor, met stoom gesteriliseerd in een autoclaaf. Als batch operaties moeten worden uitgevoerd, moet de uiteinden van chirurgische instrumenten opnieuw gesteriliseerd worden met een glaskraal sterilisator (Fine Science Tools FST 250) voor elke daaropvolgende operatie.
- Zodra de muis heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie, bepaald door de afwezigheid van een reactie op een teen kneep, wordt het geplaatst op een watje dat vervolgens wordt geplaatst op een verwarmd kussen een lichaamstemperatuur van ~ 37 ° C. handhaven De diepte van de anesthesie wordt vaak gecontroleerd tijdens de operatie.
- Fur wordt uit de dorsale hoofd in een ongeveer driehoekige ruimte ~ 3 mm caudaal van de neusgaten en zich caudaal de cervical wervels. Oftalmische zalf de ogen te beschermen tegen uitdroging en irritatie.
- De muis in ventrale recumbancy en de huid gedesinfecteerd met chirurgische jodium, 70% ethanol en steriele swabs. Een 0,8 x 1,0 cm flap van huid die het dorsale aspect van de frontale en pariëtale botten van de schedel wordt verwijderd met behulp van fijne schaar.
- Een actueel analgetische, 0,5% lidocaïne, plaatselijk aangebracht op het periosteum en het blootgestelde weefsel aan de rand van de wond. Het periosteum wordt verwijderd door voorzichtig schrapen de schedel met een scalpel, dit zal de cyanoacrylaatlijm te houden aan het bot te helpen.
- De corticale gebied van belang wordt beschreven op de schedel met een marker. Het gebied van belang moet niet worden geplaatst op schedel hechtdraad lijnen, om schade aan de onderliggende grote schepen te voorkomen.
- Een dunne laag cyanoacrylaat lijm wordt aangebracht op de wondranden om de lekkage van vloeistof te voorkomen serosanguinous en de schedel behalvehet gebied van belang.
- Licht geactiveerd tandheelkundig cement wordt in ons protocol voor het afdichten van de schedel. Voor het aanbrengen van tandheelkundige cement wordt blootgestelde schedel uitzondering van de zone voor verdunnen behandeld met de primers en vervolgens met het hechtmiddel van het licht geactiveerde tandheelkundig cement kit. Nadat het hechtmiddel is gedroogd, wordt het licht geactiveerde tandheelkundig cement toegepast op de schedel dekken. Om het hoofd van de muis voor de daaropvolgende operatie en imaging stabiliseren, wordt een steriele # 00-90 zeskantmoer ingebed in het tandheelkundig cement op afstand van het te verdunnen. Het gebruik van licht geactiveerd tandheelkundig cement laat ons toe om de schedel te bereiden, zonder te haasten om de hele procedure te beëindigen. Zodra het tandheelkundig cement preparaat op de schedel is voltooid, wordt het tandheelkundig cement uitgehard met zichtbaar licht.
- Na de tandheelkundige cement is uitgehard, wordt een helm houder van de stereotactische apparaat gemonteerd op de zeskantmoer op de muis hoofd met behulp van een # 00-90 schroef.
- Een drop van kamertemperatuur wordt 0,9% steriele zoutoplossing toegepast op de schedel gebied worden verdund. Met behulp van een stereomicroscoop, wordt een snelle micro-boor gebruikt om een cirkelvormig gebied van de schedel (typisch ~ 4-5 mm in diameter) op het gebied van belang verdunnen. Boren en de toepassing van zoutoplossing naar de geanalyseerde gebied intermitterend uitgevoerd gedurende de procedure dunner thermische verwonding aan het onderliggende hersenweefsel. Saline absorbeert warmte en helpt ook verzachten het bot.
- De muis schedel omvat twee dunne lagen compact bot daartussen een dikke laag sponsachtig bot. De buitenste laag van compact bot en de meeste sponsachtige bot verwijderd met boormachine.
- Nadat de meerderheid van het sponsachtige bot verwijderd, kunnen de overige holtes binnen het sponsachtige bot worden gezien onder een dissectiemicroscoop, wat aangeeft dat de interne boringen compact bot laag nadert. In dit stadium moet schedel dikte nog meer dan 50 urn. Schedel dunner moeten zijnverder zorgvuldig een zeer dunne (ongeveer 20 urn) en gladde preparaat te verkrijgen.
- Wanneer de gewenste dikte van de schedel wordt bereikt (~ 20 urn), wordt de schedel eerst gepolijst met een maat silicone zweep met diamantpasta (6-15 uM) gedurende ongeveer 10 minuten. De diamant-pasta polijsten dient twee doelen. Allereerst dunner verder de schedel zonder druk op de schedel verdund, zodat wordt voorkomen accidentele schade aan de onderliggende hersenweefsel. Ten tweede dient als een eerste stap voor het polijsten verdunde schedel voor het fijnkorrelige tin oxide wordt gebruikt voor verdere skull polijsten.
- Na de diamant-paste polijsten wordt het verdund schedel gepolijst met tin oxide ongeveer 10 minuten. Zodra de schedel is gepolijst, wordt de tinoxide weggespoeld met zoutoplossing tot de verdunde schedel lijkt schoon.
- In deze stap, indien de craniale venster wordt gebruikt voor lengterichting in vivo imaging, wordt het gereinigde dunne schedel gebied gedroogd. Een klein druppeltje heldercyanoacrylaat lijm wordt op de craniale venster dichten. De laag cyanoacrylaatlijm tussen de schedel en de verdunde dekglaasje moet zo dun mogelijk.
- Als een injectie wordt uitgevoerd na vorming van een craniaal venster poorten bij deze stap wordt een 26-gauge naald gebruikt om een kleine opening aan een zijde van de gepolijste dunne schedel venster te maken. Deze opening wordt gebruikt voor GBM celinjectie.
- Een steriele glazen pipet met een tipopening ongeveer 50 micrometer in doorsnede wordt getrokken met behulp van een pipet trekker. Deze pipet wordt gebruikt voor GBM celinjectie, en wordt op een micromanipulator. De pipet wordt geladen bij een hoek van 30 graden, zodat de GBM cel injectieplaats weg te zijn van de laatste imaging site. De punt van de pipet wordt verwijderd onder een dissectie microscoop. De GBM celsuspensie vindt vooral in de pipet door afzuigen met een injectiepomp.
- Nadat de injectie pipet is geladen met GBM cellen, wordt de muis verplaatst weer onder the microscoop. De injectie pipet wordt neergelaten naar de kleine opening in de craniale venster en uiteindelijk ingebracht in de hersenen via de opening met een micromanipulator. 1 pi van een GBM celsuspensie geïnjecteerd in de hersenen 100-200 iM van de hersenoppervlakte (snelheid: 0,1 ul / min, duur: 10 min).
- De schedel wordt gedroogd, wordt een druppel cyanoacrylaat lijm duidelijk aangebracht op de gedroogde schedel en een stuk van 3 mm lengtes 1 dekglaasje wordt gehecht aan de dunne en gepolijste schedel gebied. De ruimte tussen het dekglaasje en aangrenzende tandheelkundig cement wordt afgesloten met cyanoacrylaatlijm.
- Na de operatie wordt de muis subcutaan geïnjecteerd met 1 ml warm steriele zoutoplossing en voorzien van extra warmte aan lichaamstemperatuur tot volledig hersteld van anesthesie.
- Voor beeldvorming, muizen verdoofd met ketamine en xylazine bij een dosering van 0,1 mg ketamine en xylazine 0,01 mg per 1 g lichaamsgewicht. Muizen worden geïmmobiliseerd met behulp van een aangepaste stereotactische kaderonder de microscoop. Als repetitieve in vivo beeldvorming wordt uitgevoerd op dagelijkse basis, zal isofluorane een betere optie, omdat muizen zullen tekenen van afhankelijkheid vertonen met herhaald gebruik van ketamine.
2. Representatieve resultaten
Een succesvolle poorten craniale chirurgie venster kan de craniale venster duidelijke weken tot maanden blijven. Figuur 1 toont de vasculatuur onder een craniaal venster poorten gevisualiseerd met behulp van verstrooid licht. Deze vasculatuur beelden werden gebruikt als oriëntatiepunten voor het lokaliseren van dezelfde hersengebieden voor repetitieve beeldvorming. Om zowel het vaatstelsel endotheelcellen en GBM cellen te visualiseren, staken we de B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J muis, die vasculaire endotheliale cellen een etiket met het B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato ) Hze / J muizen en muizen gegenereerd met vasculaire endotheelcellen gelabeld met het rode fluorescente eiwit tdTomato. Vervolgens hebben we uitgevoerd De poorten craniotomie procedure op deze mice en geïnjecteerd GFP-gelabelde GBM cellen in hun hersenen door een kleine opening aan de zijkant van een craniaal venster. Vervolgens in vivo twee-foton imaging lengterichting op de geïnjecteerde muizen. De laser excitatie golflengte werd ingesteld op 910 nm, waardoor excitatie van zowel GFP en tdTomato. Twee-foton beeldvorming werd uitgevoerd op een speciaal ontworpen twee-foton laser scanning microscoop met twee detectoren voor gelijktijdig groen / rode fluorescentie detectievermogen. Figuur 2 toont een voorbeeld van in vivo glioma initiatie bij GBM cellen geïnjecteerd nabij het vaatstelsel. De poorten craniale venster is ook een uitstekende keuze voor chronische time-lapse in vivo beeldvorming. Figuur 3 toont GFAP kleuring van corticale delen van een muis zonder poorten operatie, een muis 7 dagen na de operatie poorten, en een muis 7 dagen na Poorten chirurgie en zoutoplossing voor injectie. Blijkt uit de beelden die de muis zonder chirurgie en de muis met HavenbedrijfTS operatie niet gliosis, dat na zoutoplossing voor injectie gliosis waargenomen in de hersenen van de muis, door het binnendringen en zoutoplossing pipetteren in de hersenen. Dit resultaat toont aan dat gliosis niet voorkomt onder de poorten craniale venster, onafhankelijke validatie dat de poorten craniale venster hier beschreven niet leidt tot de gliosis die typisch gepaard gaat met een "open schedel" chronische craniale venster. Figuur 4 toont een hoge resolutie beeldvorming van dendritische spines van dezelfde muis op de dag van de operatie (dag 0) en 32 dagen na de poorten venster schepping (Dag 32), waaruit blijkt dat de havens venster ook is een uitstekende keuze voor hoge-resolutie in vivo beeldvorming.
Figuur 1. Visualisatie van bloedvaten onder een gepolijste en versterkte uitgedund schedel schedel venster met behulp van verstrooid licht. Dagen vertegenwoordigen t Hij aantal dagen na chirurgie; beelden genomen vanaf de dag van de operatie onmiddellijk na voltooiing van GBM celinjectie. Scale bar:. 0,5 mm Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Visualisatie geïnjecteerde GBM cellen en bloedvaten in vivo. Muizen die zowel Tek-Cre en ROSA26 CAG-tdTomato werden gebruikt voor de GBM cellen injectie. Vasculaire endotheliale cellen werden gemerkt met tdTomato (rood) en GBM cellen werden gemerkt met GFP (groen). Beelden werden verkregen vanaf 24 uur na GBM celinjectie. Een totaal van 10-12 aangrenzende zichtveld genomen zijn verzameld naast elkaar, met de geïdentificeerde geïnjecteerd GBM cellen in het midden van het totale veld om de uiteindelijke beelden. Dagen staan voor het aantal dagen na de operatie. Scale bar: 100 urn.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Gliosis doet zich niet voor volgende poorten craniale venster chirurgie. Bovenste panelen: Muis hersenen coronale sectie onder lagere vergroting. Linkerpaneel: een muis zonder craniale venster operatie, geen GFAP activering wordt waargenomen in het hersenweefsel. Middelste panel: een muis met poorten craniale venster gegenereerd aan de rechterkant van de hersenen, geen activatie GFAP waargenomen in het hersenweefsel. Rechter paneel: een muis met een Poorten craniale venster en zoutoplossing injectie van de kant van de havens venster. GFAP activering wordt waargenomen aan de zijde van de poorten raam, maar niet aan de zijde van intact hersenweefsel. Schaal bar: 1 mm. Onderpaneel: hogere macht beelden van de hersenen weefsels in gebieden zoals aangegeven in de witte doos van de bovenste paneel beelden. Scale bar: 100 urn. 
Figuur 4. Hoge-resolutie beeldvorming van dendritische spines van Thy-1 YFPH muizen. Beelden werden verkregen op de dag van poorten chirurgie, en 32 dagen na de poorten operatie. Uit de beelden die meest stekels aanwezig op dag 0 duidelijk zichtbaar 32 dagen na operatie poorten. Scale bar: 2 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sleutel tot een succesvolle poorten craniale venster is het dunner worden en polijsten. Terwijl de eerste verdunning kan snel worden uitgevoerd, moet erop worden toegezien homogene dunner worden van de schedel over een groot gebied. We gewoonlijk een dunne laag van zoutoplossing naar de schedel en dun de schedel een keer per keer, zodat de zoutoplossing verdampt kort na de microdrill is gepasseerd wanneer de schedel. Hierdoor kunnen we langzaam maar homogeen verder dun de schedel. Een vaste hand onder de microscoop is ook de sleutel. Zodra schedel-dunner nadert de beoogde dikte, wij normaal gesproken gebruiken diamant plakken om de verdunde schedel poetsen gedurende 10-15 minuten, gevolgd door polijsten met behulp van tin oxide. We vinden dat de hard verdund schedel eerst met diamantpasta beter polijstresultaat in het algemeen levert en kunnen we ook een groot gebied dunne schedel gebied verder zonder toepassing veel druk op de schedel verdunde omgeving.
We kozen voor de poorten cranial venster in plaats van andere veelgebruikte craniale vensters, zoals de "open schedel" venster en de "verdunde schedel" venster, om de volgende redenen: Met de open schedel raam, de craniale venster wordt meestal bewolkt kort na creatie en vervolgens licht omhoog op zichzelf binnen de eerste twee weken, hetgeen dus een wachttijd van ongeveer twee weken voordat imaging experimenten worden uitgevoerd. Deze twee weken wachttijd zou voorkomen visualisatie van glioom initiatie in de eerste twee weken na GBM cel injectie. De verdunde schedel craniale venster is repetitief dunner voor elke opnamesessie, waardoor zij ongeschikt zijn voor GBM cellen injectie en visualisatie van glioom initiatie op een dagelijkse basis. In tegenstelling, de poorten venster kunnen we GBM celinjectie uitvoeren vanaf de zijkant van het venster, dat schade beperkt aan het hersenweefsel en zorgt tevens voor de uitvoering van hoge-resolutie afbeelding direct na instelling van het venster. Informatie op glioma opening kunnen binnen de eerste paar weken na GBM celinjectie, wat een belangrijk voordeel boven de open schedel techniek voor dergelijke studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant en The Maine Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
