Summary
Grazie alla combinazione di un lucido e rafforzata sottile cranio (porte) cranica finestra e il glioblastoma (GBM) l'iniezione di cellule, possiamo osservare l'inizio glioma e la crescita di cellule di GBM iniettate nel cervello di un topo vivo longitudinalmente.
Abstract
Glioma è una delle forme più letali di cancro umano. La terapia più efficace per glioma data-chirurgia seguita da radioterapia-offre ai pazienti solo benefici modesti, come la maggior parte dei pazienti non sopravvive più di cinque anni dopo la diagnosi a causa di 1,2 glioma ricaduta. La scoperta delle cellule staminali tumorali nei tumori cerebrali umani promette di avere un impatto enorme sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma 3. Cellule staminali tumorali sono definite dalla loro capacità sia di auto-rinnovarsi e differenziarsi, e si pensa siano le uniche cellule di un tumore che hanno la capacità di avviare nuovi tumori 4. Glioma radioterapia recidiva seguente è pensato per derivare da resistenza delle cellule staminali di glioma (GSC) alla terapia 5-10. In vivo, GSC sono mostrati di risiedere in una nicchia perivascolare che è importante per mantenere le loro cellule staminali-simili caratteristiche 11-14 . Al centro della organizzazionezione della nicchia GSC sono cellule endoteliali vascolari 12. I dati esistenti suggeriscono che la GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari sono importanti per lo sviluppo del tumore, e identificare GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali come importanti bersagli terapeutici per glioma. La presenza di GSC è determinato sperimentalmente in base alla capacità di avviare nuovi tumori upon trapianto ortotopico 15. Questo è in genere ottenuto iniettando un certo numero di cellule isolate da GBM tumori umani nel cervello di gravemente immuno-carente topo, o di cellule di topo GBM nel cervello di topi ospitanti congenici. Saggi di crescita tumorale vengono poi effettuate dopo un tempo sufficiente a consentire GSC tra le cellule iniettate GBM dare origine a nuovi tumori-tipicamente diverse settimane o mesi. Quindi, saggi esistenti non consentono esame del processo patologico importante di iniziazione tumore da GSC singoli in vivo. Di conseguenza, i essenzialensights nei ruoli specifici di GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari nelle prime fasi di iniziazione tumorale mancano. Questi germi di pensiero sono fondamentali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma, e avrà grandi implicazioni per la prevenzione delle recidive nei pazienti con glioma. Qui abbiamo adattato le porte procedura cranica finestra 16 e in vivo a due fotoni microscopia per permettere la visualizzazione di iniziazione del tumore dalle cellule GBM iniettate nel cervello di un topo vivo. La nostra tecnica aprirà la strada per futuri sforzi per chiarire i principali meccanismi di segnalazione tra GSC e cellule endoteliali vascolari durante l'iniziazione glioma.
Protocol
1. Protocollo
- Anestetizzare il mouse con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. Carprofen (0,005 mg per 1 g di peso corporeo) è utilizzato per analgesia e viene somministrato prima dell'intervento.
- Tutti gli strumenti chirurgici, compresa la punta dentale, sono sterilizzati a vapore in autoclave. Se ambulatori lotti devono essere eseguite, le punte di strumenti chirurgici devono essere sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore (Belle Scienza Strumenti FST 250) prima di ogni intervento chirurgico successivo.
- Una volta che il mouse ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, valutato da mancanza di una risposta a una presa punta, viene posto su un dischetto di cotone che viene poi posto su un pad riscaldato per mantenere una temperatura corporea di ~ 37 ° C. La profondità di anestesia viene monitorata frequentemente durante l'intervento chirurgico.
- Pelliccia viene rimossa dalla testa dorsale in una zona approssimativamente triangolare ~ 3 mm caudale alle narici ed estendendo caudalmente al cervical vertebre. Pomata oftalmica è applicato occhi per proteggerli da disidratazione e irritazione.
- Il mouse viene posizionato in recumbancy ventrale e la pelle viene disinfettato con iodio chirurgica, 70% di etanolo, e tamponi sterili. Un x 0,8 1,0 cm pattina di pelle che ricopre il dorso delle ossa frontali e parietali del cranio viene rimosso con le forbici sottili.
- Un analgesico topico, 0,5% lidocaina, viene applicato localmente sul periostio e tessuti esposti alla periferia della ferita. Il periostio viene rimosso delicatamente raschiando il cranio con una lama di bisturi; questo aiuterà la colla cianoacrilato di aderire all'osso.
- L'area corticale di interesse è descritta sul cranio con un pennarello. L'area di interesse non deve essere posizionato su linee di sutura del cranio, per evitare danni alle navi di grandi dimensioni sottostanti.
- Un sottile strato di adesivo cianoacrilato è applicato ai margini della ferita, per impedire la fuoriuscita di liquido sanguinolento, e al cranio salvol'area di interesse.
- Fotoattivabile cemento dentale viene utilizzato nel nostro protocollo per sigillare il cranio. Prima dell'applicazione del cemento dentale, tutte cranio esposto tranne l'area destinata assottigliamento viene trattato con primer e successivamente con il legante dal fotoattivabile kit cemento dentale. Una volta che l'adesivo è essiccato, il fotoattivabile cemento dentale viene applicato per coprire il cranio. Per stabilizzare la testa del topo per la chirurgia successiva e di imaging, una sterile # 00-90 dado esagonale è incorporato nel cemento dentale a distanza dalla zona di essere assottigliato. L'utilizzo della luce-attivato cemento dentale ci permette di preparare il cranio senza dover correre per completare l'intera procedura. Dopo la preparazione del cemento dentale sul cranio è completata, il cemento dentale viene indurito con luce visibile.
- Dopo il cemento dentale viene indurita, un supporto copricapo dal dispositivo stereotassica è montato il dado esagonale sulla testa mouse usando una vite # 00-90.
- A drop di temperatura ambiente, 0,9% soluzione salina sterile viene applicato alla zona cranio per essere assottigliato. Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, ad alta velocità micro-trapano viene utilizzato per diluire un'area circolare del cranio (tipicamente ~ 4-5 mm di diametro) sopra la regione di interesse. Foratura e l'applicazione della soluzione salina per la zona forata vengono eseguite intermittenza durante la procedura di assottigliamento per evitare danno termico al tessuto sottostante cerebrale. Saline assorbe calore e aiuta anche ammorbidire l'osso.
- Il cranio del mouse è composto da due sottili strati di osso compatto, sandwich uno spesso strato di osso spugnoso. Lo strato esterno di osso compatto e più dell'osso spugnoso vengono rimossi con il trapano.
- Dopo la maggioranza dell'osso spugnoso viene rimosso, le cavità rimanenti all'interno dell'osso spugnoso può essere visto sotto un microscopio da dissezione, che indica che si sta avvicinando alla foratura strato interno osso compatto. In questa fase, lo spessore cranio dovrebbe essere ancora più di 50 pm. Skull diradamento deve esserecontinuato accuratamente per ottenere una preparazione molto sottile (circa 20 micron) e liscia.
- Una volta che lo spessore desiderato del cranio è ottenuta (~ 20 micron), il cranio viene prima lucidata con una misura frusta in silicone con pasta diamantata (6-15 micron) per circa 10 minuti. Il diamante, pasta per lucidatura serve a due scopi. In primo luogo, si assottiglia ulteriormente il cranio senza applicare pressione sul cranio assottigliato, evitando in tal modo i danni accidentali al tessuto cerebrale sottostante. In secondo luogo, serve come una fase di lucidatura iniziale per il cranio diluito prima della grana fine ossido di stagno è usata per la lucidatura cranio ulteriormente.
- Dopo il diamante pasta lucidante, il cranio diluito viene lucidato con ossido di stagno per circa 10 min. Una volta che il cranio è lucido, l'ossido di stagno viene lavata via con soluzione fisiologica fino a quando il cranio appare assottigliato pulito.
- A questo punto, se la finestra cranica è da utilizzare per longitudinale imaging in vivo, la zona pulita cranio sottile viene essiccato. Una piccola goccia di chiaracolla di cianoacrilato è applicato per sigillare la finestra cranica. Lo strato di colla cianoacrilato tra il cranio assottigliato e il coprioggetto deve essere il più sottile possibile.
- Se l'iniezione deve essere eseguita dopo la creazione di una finestra porti cranica, in questa fase, un 26-gauge siringa viene usato per creare una piccola apertura su un lato del cranio lucido sottile finestra. Questa apertura è utilizzato per l'iniezione di cellule GBM.
- Una pipetta di vetro sterile con una punta di apertura di circa 50 micron di diametro viene tirato con un estrattore pipetta. Questo pipetta sarà utilizzato per l'iniezione di cellule GBM, e viene caricato su un micromanipolatore. La pipetta è caricato in un angolo di 30 gradi in modo che il GBM sito di iniezione delle cellule sarà lontano dal sito di imaging finale. La punta della pipetta viene rimosso sotto un microscopio di dissezione. La sospensione cellulare è GBM caricato frontalmente nella pipetta per aspirazione usando una pompa a siringa.
- Una volta che la pipetta di iniezione è caricato con cellule GBM, il mouse viene spostato indietro in the microscopio. La pipetta di iniezione si abbassa verso la piccola apertura nella finestra craniale ed infine inserito nel cervello attraverso l'apertura utilizzando un micromanipolatore. 1 ml di sospensione cellulare GBM viene iniettato nel cervello 100-200 micron dalla superficie del cervello (velocità: 0,1 microlitri / min, durata: 10 min).
- Il cranio è essiccato, una piccola goccia di colla di cianoacrilato chiaro viene applicato al cranio essiccato, e un pezzo di 3 mm di dimensione # 1 coprioggetto viene fatto aderire alla superficie del cranio sottile e lucido. Lo spazio tra il vetrino e adiacente cemento dentale è sigillato con colla cianoacrilato.
- Dopo l'intervento chirurgico, il mouse viene iniettato per via sottocutanea con 1 ml di soluzione salina calda sterile e dotato a calore per mantenere la temperatura corporea fino alla completa guarigione da anestesia.
- Per l'imaging, i topi vengono anestetizzati con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. I topi sono immobilizzate con un telaio su misura stereotassicosotto il microscopio. Se ripetitivo imaging in vivo è effettuata su base giornaliera, isofluorano sarà una scelta migliore, come topi mostrano segni di dipendenza con l'uso ripetitivo di ketamina.
2. Risultati rappresentativi
Un successo l'intervento chirurgico finestra Porte cranica permette la finestra cranica rimanere chiaro per settimane o mesi. Figura 1 mostra la vascolarizzazione sotto una finestra porte cranica visualizzato per mezzo di luce riflessa. Queste immagini vascolatura stati usati come punti di riferimento per la localizzazione stesse aree cerebrali per l'imaging ripetitivo. Per visualizzare sia le cellule endoteliali e le cellule vascolarizzazione GBM, abbiamo attraversato il B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J del mouse, che etichetta cellule endoteliali con la B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J del mouse, e generata topo con cellule endoteliali vascolari etichettati con il tdTomato rosso proteina fluorescente. Abbiamo quindi effettuato la procedura di craniotomia porte su questi mice, e iniettata GFP marcati GBM cellule nel cervello attraverso una piccola apertura sul lato di una finestra cranica. Abbiamo quindi effettuato in vivo a due fotoni di imaging longitudinalmente sui topi iniettati. La lunghezza d'onda di eccitazione del laser è stato fissato a 910 nm, che ha portato l'eccitazione di entrambi GFP e tdTomato. Due fotoni di imaging è stato eseguito su una fuoriserie due fotoni a scansione laser con due rivelatori per simultanea capacità verde / rosso rilevazione della fluorescenza. Figura 2 mostra un esempio in vivo di apertura da cellule di glioma GBM iniettato vicino la vascolarizzazione. La finestra porti cranica è anche una scelta eccellente per cronica time-lapse imaging in vivo. Figura 3 mostra una colorazione GFAP di sezioni corticali da un mouse senza intervento chirurgico porte, un mouse 7 giorni dopo l'intervento porti, e un mouse 7 giorni dopo l'intervento chirurgico porti e iniezione di soluzione salina. È evidente dalle immagini che il mouse senza intervento chirurgico e il mouse con PoRTS chirurgia non hanno gliosi, mentre dopo l'iniezione salina, gliosi è osservata nel tessuto cerebrale di topo, per pipettare penetrazione e iniezione salina nel cervello. Questo risultato dimostra che gliosi non si verifica sotto la finestra porti cranica, che fornisce una convalida indipendente che le porte finestra cranica qui descritte non comporti la gliosi che è in genere associato a un "aperto skull" finestra cronica cranica. Figura 4 mostra ad alta risoluzione imaging di spine dendritiche dal mouse stesso il giorno dell'intervento (giorno 0) e 32 giorni dopo la creazione della finestra porte (giorno 32), a dimostrazione che la finestra porti è anche una scelta eccellente per l'alta risoluzione imaging in vivo.
Figura 1. Visualizzazione dei vasi sotto una finestra lucido e armato cranio diluito cranica con luce riflessa. Giorni rappresentano t l numero di giorni dopo l'intervento, le immagini sono state scattate a partire dal giorno dell'intervento chirurgico subito dopo il completamento della iniezione di cellule GBM. Scala bar:. 0,5 millimetri Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Visualizzazione delle cellule iniettate GBM e vascolarizzazione in vivo. I topi che trasportano sia Tek-Cre e ROSA26 CAG-tdTomato sono stati utilizzati per l'iniezione di cellule GBM. Cellule endoteliali vascolari sono state marcate con tdTomato (rosso), e le cellule sono state marcate con GBM GFP (verde). Le immagini sono state acquisite a partire 24 ore dopo l'iniezione di cellule GBM. Un totale di 10-12 campi adiacenti di vista sono stati prelevati e sono stati assemblati adiacenti l'una all'altra, con le celle identificate GBM iniettato nel centro del campo totale, per produrre le immagini finali. Giorni rappresentano il numero di giorni dopo l'intervento chirurgico. Scala bar: 100 micron.href = target "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Gliosi non si verifica dopo l'intervento finestra Porte cranica. I pannelli superiori: cervello sezione coronale del mouse in basso ingrandimento. Sinistra: un mouse senza alcun intervento chirurgico finestra cranica; non si osserva l'attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello centrale: un mouse con una finestra porte cranica generata sul lato destro del cervello, non si osserva attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello di destra: un mouse con una finestra porte cranica e iniezione salina dal lato della finestra Porte. Attivazione GFAP è osservato il lato della finestra porte, ma non sul lato del tessuto cerebrale intatto. Scala bar: 1 mm. Pannello inferiore: più potenza immagini dei tessuti cerebrali in aree come indicato nella casella bianca della parte superiore del pannello immagini. Scala bar: 100 micron. 
Figura 4. Imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche di Thy-1 topi YFPH. Le immagini sono state acquisite sul giorno dell'intervento porte, e 32 giorni dopo l'intervento porti. E 'evidente dalle immagini che la maggior parte spine presentano al giorno 0 sono chiaramente visibili 32 giorni dopo l'intervento porti. Scala bar: 2 micron.
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Discussion
La chiave per una finestra portuale di successo del cranio è l'assottigliamento e la lucidatura. Mentre il diradamento iniziale può essere eseguita rapidamente, occorre prestare attenzione a garantire assottigliamento omogenea del cranio su una vasta area. Abbiamo tipicamente applicare un sottile strato di soluzione salina al cranio, e quindi un passaggio sottile il cranio alla volta, in modo tale che la soluzione salina evapora poco dopo la microdrill è passato sopra la volta cranica. Questo ci permette di lentamente ma omogeneamente più sottile del cranio. Una mano ferma sotto il microscopio è anche la chiave. Una volta che si avvicina cranio-assottigliamento dello spessore previsto, come normalmente si usa pasta diamantata per lucidare il cranio diluito per 10-15 minuti, con successiva lucidatura con ossido di stagno. Troviamo che lucidare il cranio diluito prima con pasta diamantata produce un risultato migliore lucidatura in generale, e permette anche di promuovere sottile una grande area di superficie cranio senza applicare una pressione molto sull'area cranio assottigliato.
Abbiamo scelto il cr portefinestra anial piuttosto che altre finestre di uso comune del cranio, come il "cranio aperto" finestra e la "assottigliato teschio" finestra, per i seguenti motivi: Con la finestra aperta cranio, la finestra del cranio di solito diventa nuvoloso poco dopo la creazione e poi si risolve da solo entro le prime due settimane, il che richiede un periodo di attesa di circa due settimane prima che gli esperimenti di imaging possono essere eseguite. Questo due settimane periodo di attesa di impedire la visualizzazione di apertura glioma durante le prime due settimane dopo l'iniezione delle cellule GBM. La finestra cranio diluito cranica è necessario diradamento ripetitiva prima di ogni sessione di imaging, che lo rende adatto per l'iniezione di cellule GBM e la visualizzazione di apertura glioma su base giornaliera. In contrasto, la finestra Porte ci permette di eseguire l'iniezione GBM cella dal lato della finestra, che riduce al minimo i danni al tessuto cerebrale, e consente anche di prestazioni di alta risoluzione creazione di immagini immediatamente seguente della finestra. Informazioni sul glioma iniziazione possono essere raccolte entro le prime settimane dopo l'iniezione delle cellule GBM, che è un vantaggio rispetto alla tecnica cranio aperto per questo tipo di studi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da Il Laboratorio pilota di Grant Jackson Cancer Center e The Maine Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
