Summary
Metafase at anafase overgang udløses gennem anaphase-fremmende kompleks (APC / C)-afhængig ubiquitinering og efterfølgende destruktion af cyclin B. Her har vi oprettet et system, som efter puls-chase mærkning, mulighed for at overvåge cyclin B proteolyse i hele cellepopulationer og letter påvisning af indblanding fra mitotisk checkpoint.
Abstract
Ligelig fordeling af kromosomer mellem de to datterceller ved celledeling er en forudsætning for at sikre genetisk stabilitet 1. Unøjagtigheder i kromosom separation er kendetegnende for malignitet og forbundet med progressiv sygdom 2-4. Spindlen samling checkpoint (SAC) er en mitotisk overvågningsmekanisme, som holder tilbage celler på metafase indtil hver enkelt kromosom har etableret en stabil bipolar tilknytning til mitotiske spindel 1. SAC udøver sin funktion ved interferens med aktiverende APC / C underenhed Cdc20 at blokere proteolyse af Securin og cyclin B og dermed kromosom separation og mitotisk exit. Forkert montering af kromosomer forhindrer silencing af SAC-signalering og forårsager fortsat hæmning af APC / C Cdc20 indtil problemet er løst for at undgå kromosom missegregation, aneuploidi og maligne vækster 1.
De fleste undersøgelser, der behandles på influence af forkert kromosomal fastgørelse på APC / C-afhængige proteolyse benyttede sig af spindel forstyrrelser ved hjælp af depolymerisering eller mikrotubulus-stabiliserende medicin til at forstyrre kromosomale tilknytning til mikrotubuli. Da interferens med mikrotubuli kinetik kan påvirke transport og lokalisering af kritiske regulatorer, disse procedurer bærer en risiko for at fremkalde kunstige effekter 5.
At undersøge, hvordan SAC interfererer med APC / C-afhængige proteolyse af cyclin B under mitose i uperturberede cellepopulationer, vi etableret et histon H2-GFP-baseret system, der tillod samtidig overvågning af metafase tilpasning af mitotiske kromosomer og proteolyse af cyclin B 6 .
At skildre proteolytiske profiler, genererede vi et kimært cyclin B reportermolekyle med en C-terminal SNAP del 6 (fig. 1). I en individuel mærkning reaktion er SNAP-delen i stand til at danne kovalente bindinger medalkylguanin-bærere (SNAP substrat) 7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er let tilgængelige og bære et bredt spektrum af forskellige fluorochromer. Kimære cyclin B-SNAP-molekyler bliver mærket ved tilsætning af membran-permeable SNAP substrat til vækstmediet 7 (figur 1). Efter mærkningsreaktionen, falder cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaktion-lignende måde og fluorescensintensiteter afspejler niveauer af cyclin B nedbrydning 6 (fig. 1). Vores system letter overvågningen af mitotiske APC / C-afhængig proteolyse i et stort antal celler (eller flere cellepopulationer) parallelt. Derved kan systemet være et værdifuldt redskab til at identificere agenter / små molekyler, der kan interferere med proteolytisk aktivitet ved metafase til anafase overgangen. Øvrigt, som det syntese af cyclin B under mitose for nylig blevet foreslået som en vigtig mechanism at fremme en mitotisk blok i mus og mennesker ved at holde cyclin B ekspressionsniveauer stabile 9,10, dette system muligt for os at analysere cyclin B proteolyse som et element i en ligevægtssituation 6.
Protocol
1. Såning af U2OS-baserede cyklin B-SNAP Reporter celler (klon 11 Celler 6) på Microscope Chamber Slides
- Trypsinisér subkonfluente SNAP reporter-celler, der fik lov til at vokse asynkront i logaritmisk fase i mindst 48 timer.
- Arbejde med 8 brønde mikroskop kamre (konstant fordeling af celler).
Til podning af celler på 8 brønde mikroskop kamre ved en konstant fordeling over hele overfladen af mikroskopet kammeret, centrifuge 10.000 celler og resuspenderes i 350 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium (suppleret med 10% føtalt okseserum, penicillin / streptomycin og natriumpyruvat). Overførsel cellesuspension til mikroskopet kammer (figur 2).
Arbejde med 8 brønde mikroskop kamre (maksimal celledensitet i midten).
Til podning af celler på et højere densitet i midten af mikroskopet chambis, fylde kammeret med 300 gl af phenolrødt-frit normalt vækstmedium. Tilføj 5.000 celler forsigtigt til midten af mikroskopet kammer (figur 2).
Arbejde med 96 brønde særlige optik plader (konstant fordeling af celler).
Til podning af celler på plader med 96 brønde ved en konstant fordeling over hele overfladen af brønden, centrifugeres 5.000 celler og resuspenderes i 300 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium. Overfør cellesuspension til en plade med 96 brønde. Afhængigt af det totale antal af celle-holdige nødvendige boringer, celleantallet og det totale volumen af suspensionen medium (figur 2) justeres.
Arbejde med 96 godt Specialoptikken plader (maksimal celledensitet i midten).
Til podning af celler på 96-brønds plader, der forsigtigt tilsættes 1.500 celler i 15 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium i en small dråbe i midten af hver brønd for at opnå en begrænsning af cellevækst til centrum af brønden (figur 2).
- Tillad podede celler til at vokse i mindst 18 timer under standard cellekultur betingelser (37 ° C, 100% luftfugtighed, 5% CO2).
2. Farvning af Reporter Cells med SNAP Substrat
- 30 minutter før begyndelsen af farvningsproceduren tillader alikvoter af phenolrødfri normalt vækstmedium at varme op til 37 ° C.
- For nem håndtering af SNAP substratet (i vores tilfælde TMR stjerne) opløses TMR stjerne i DMSO til en koncentration i stamopløsningen af 400 uM, som kan opbevares ved -20 ° C.
- Før farvning, fortyndes 0,5 pi TMR stjerne stamopløsning i 200 pi phenolrødfri normalt vækstmedium (37 ° C) til opnåelse af en endelig mærkning koncentration på 1 uM.
- Fjern normalt vækstmedium fra de asynkront voksende celler og inkuberes i labeling medium i 25 minutter under standard dyrkningsbetingelser.
- Fjern mærkning medium og vask cellerne fire gange med phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C). Cellerne inkuberes i 300 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C) i 30 min. Forud for transport til mikroskopet udskifte mediet med frisk phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C) for at fjerne tilbageværende ubundet SNAP substrat.
- Transport celler til mikroskop i et styrofoam æske på en forvarmet (37 ° C) varmeblok at minimere temperaturudsving.
3. Måling af fluorescensintensitet
- To timer forud for analysen justere lufttemperatur af klimakammeret til 37 ° C i tør tilstand, for at bringe hele mikroskop med alle dens komponenter til den ønskede temperatur. Forvarmning før indstilling af fugtighed er vigtig for at undgå kondensation og efterfølgende skade på mikroskopet.
- Juster luftfugtighed to 60% og CO 2 til 5% forud for analysens begyndelse.
- Start Scan ^ R Acquisition software og definere standardindstillinger (se tabel 1).
- Definerer positionerne af brøndene, der skal analyseres.
- Definer ATm (erhvervelse cyklus tid) og det absolutte antal af køb cyklusser.
- Hvis analyse af et større antal brønde ønskes, vælges hardware autofokus, ellers er det tilstrækkeligt at bruge software autofokus alene.
- Start erhvervelse og tilsyn for de to første køb cykler. Mikroskopet vil fokusere på histon H2-GFP signal, med efterfølgende erhvervelse af et første billede i den pågældende kanal før filteret ændres, og den tilsvarende TMR stjerne billedet er erhvervet (fig. 3). Dette gentages for alle positioner inden for en brønd, og for hver af de brønde, der skal undersøges, før gentagelse igen den næste cyklus.
4. Analyse af proteolytiske profiler usynge Scan ^ R
- Start Scan ^ R Analysis-softwaren og analysere billeder med cellekerner, som visualiseret ved histon H2-GFP, defineret som hovedformål, under anvendelse af en tærskelværdi baseret på signalintensitet og et vendepunkt algoritme for at hjælpe til adskillelse af naboceller. En underobjekt bestående af en kerne med cytoplasmaet bør skabes for TMRstar analyse. (Vigtige egenskaber hovedformål er X og Y positioner, tid og maksimal og gennemsnitlig intensiteter af GFP til hovedformål og den samlede intensitet divideret med område for TMRstar underobjekt.) Denne analyse proces kan tage flere timer på grund af store data mængder.
- Skifter til sporingstilstand at visualisere underobjekt middel TMR stjerne fluorescensintensitet med tiden (celle spor), tildeles de analyserede store objekter (figur 4). Antallet af celler, der skal undersøges, kan indsnævres ved gating på disse målinger varighed mindst 140 cykler og med en høj maksimal intensitet på H2-GFP. Served større antal celler tillader en første repræsentant og objektiv (fig. 4).
- Markere en celle spor af interesse at visualisere histon H2-GFP og TMR stjerne fluorescens samtidig på enkeltcelle-niveau (figur 5A).
- Brug den rigtige museklik på en celle af interesse og generere en eksporteres billedgalleri til illustration af histon H2-GFP og cyclin B-SNAP TMR stjerne for hver enkelt tidspunkt.
- Skift til befolkningen tilstanden af Scan ^ R Analysis software og gate det område, hvor cellen af interesse er repræsenteret i X versus Y dot-plot (fig. 5B).
- Anvende et nyt dot-plot vindue til gated region og visualisere betyder TMR stjerne fluorescensintensiteten med tiden (figur 5C).
- Eksporter data (tid og fluorescensintensitet) til Microsoft Excel til videre beregning.
5. Repræsentative resultater
Figure 5D og 5E viser cyclin B kinetik, ved en TMR stjerne fluorescensintensitet kurve, af en celle, der fortsætter gennem en regelmæssig mitose uden tegn på kromosomalt forskydning (fig. 5E). Ved komprimering af cytoplasmaet efter kernemembranen opdeling (NEBD, som indikeret ved rød trekant), viser TMR stjerne fluorescensintensitet en brat stigning indtil isomorf vindue (lysere område i diagrammet) nås, når cellen træder ind prometaphase 6. Fluorescensintensitet forbliver på et stabilt niveau, så længe cellen fortsætter gennem profase og metafase og derefter begynder at falde hurtigt efter alle kromosomerne har etableret en stabil metafase plade (figur 5D og 5E). Denne drop forud kromosom adskillelse under anaphase (blå prik på kurven). I slutningen af mitose kromatin begynder at decondense (blå søjler) og cellen vedtager interfase morfologi mens fluorescensintensiteten kurven nærmer sig enplateau, som er lavere end plateau før mitose (fig. 5D og 5E).
Autofokus-indstillinger | Histon H2-GFP (hovedformål erhvervelse indstillinger) | Cyclin B-SNAP mærket med TMR stjerne (Erhvervelse indstillinger) | Acquisition cyklustid Repetitions |
Grov autofokus + / -39 um 24 Lag Fin autofokus + / -5,4 Um 14 Lag | GFP filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 100 ms Lys intensitet: 25% | TRITC filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 150 ms Lys intensitet: 33,3% | 2-5 min. |
GFP filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 12 ms Lys intensitet: 12,5% | Op til 48 h med fortsat analyse (begrænset af reduceret luftfugtighed på 60%) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B.
Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998). - Fletcher, D. A., Mullins, R. D.
Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010). - Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).