Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties
Summary
Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.
Abstract
Gelijke verdeling van de chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een voorwaarde voor het waarborgen van de genetische stabiliteit 1. Onjuistheden in de loop van chromosoom scheiding zijn een kenmerk van maligniteit en geassocieerd met progressieve ziekte 2-4. De assemblage van de spoel checkpoint (SAC) is een mitotische surveillance mechanisme dat tegenhoudt cellen in metafase tot elk chromosoom heeft een stabiele bipolaire gehechtheid aan de mitotische spindel 1. De SAC oefent zijn functie door interferentie met de activerende APC / C subunit Cdc20 voor proteolyse van securin en cycline B en dus chromosoom scheiding en mitotische uitgang blokkeren. Onjuiste bevestiging van chromosomen voorkomt silencing van SAC signalering en veroorzaakt voortgezet remming van APC / C Cdc20 totdat het probleem is opgelost op chromosoom missegregation, aneuploïdie en kwaadaardige gezwellen te voorkomen 1.
De meeste studies die de i aangepaktnfluence van onjuiste chromosomale beslag op APC / C-afhankelijke proteolyse maakte gebruik van as verstoring met depolymeriseren of microtubuli-stabiliserende medicijnen te bemoeien met chromosomale gehechtheid aan microtubuli. Omdat interferentie met microtubule kinetiek kan het transport en lokalisatie van kritische regulators beïnvloeden deze procedures voorzien van een risico op het induceren kunstmatige effecten 5.
Om te onderzoeken hoe de SAC interfereert met APC / C-afhankelijke proteolyse van cycline B tijdens de mitose in onverstoorbaar celpopulaties, hebben we een histon H2-GFP-gebaseerd systeem waardoor de gelijktijdige monitoring van metafase afstemming van mitotische chromosomen en proteolyse van cycline B 6 .
Proteolytische profielen tonen, maakten wij een chimeer cycline B reporter molecuul met een C-terminale deel SNAP 6 (figuur 1). In een zelf-labelingsreactie, de SNAP-groep kan covalente bindingen vormen metalkylguanine-dragers (SNAP substraat) 7,8 (figuur 1). SNAP substraatmoleculen zijn gemakkelijk verkrijgbaar en hebben een breed spectrum van verschillende fluorochromen. Chimere cycline B-SNAP moleculen worden gelabeld na toevoeging van het membraan doorlatend substraat SNAP het kweekmedium 7 (figuur 1). Na de labelingsreactie, de cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit druppels in een pulse-chase reactie-achtige wijze en fluorescentie-intensiteiten tijdens niveaus van cycline B afbraak 6 (figuur 1). Ons systeem vergemakkelijkt de controle op mitotische APC / C-afhankelijke Proteolyse in grote aantallen cellen (of meerdere celpopulaties) in parallel. Daardoor kan het systeem een waardevol instrument om agenten / kleine moleculen die in staat zijn met proteolytische activiteit interfereren bij de metafase anafase om de overgang te identificeren. Bovendien is de synthese van cycline B tijdens mitose Onlangs werd een belangrijk mechanistischm in het bevorderen van een mitotische blok in muizen en mensen door het houden van cycline B expressie niveaus stabiel 9,10, dit systeem ons in staat om cycline B proteolyse te analyseren als een element van een evenwichtige balans 6.
Protocol
Discussion
We presenteren hier een live-cell imaging benadering het vergemakkelijken van de gelijktijdige bewaking van cycline B proteolyse en chromosoom uitlijning. Deze aanpak maakt het mogelijk de studie van de mitotische controle in celpopulaties onverstoorbaar op de enkele cel niveau. Cycline B afbraakcurven vergemakkelijken direct inzicht in de activiteit van de APC / C en daarmee indirect geven de status van de SAC 6.
Deze benadering, hoewel vastgesteld op basis van de Scan ^ R softwa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor S. Taylor voor het verstrekken van de pLPCX-histon H2-GFP plasmide. Wij danken R. Mertelsmann voor continue ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
