L'étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières
Summary
Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l'anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l'ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.
Abstract
Répartition égale des chromosomes entre les cellules filles deux au cours de la division cellulaire est une condition sine qua non pour garantir la stabilité génétique 1. Inexactitudes lors de la séparation des chromosomes sont une caractéristique de malignité et associée à une maladie progressive 2-4. Le point de contrôle de groupe de broches (CSC) est un mécanisme de surveillance mitotique qui retient les cellules de métaphase jusqu'à ce que chaque chromosome unique a établi une fixation bipolaire stable à la broche 1 mitotique. Le CSC exerce sa fonction par interférence avec l'activation APC / C Cdc20 sous-unité pour bloquer la protéolyse de Securin et la cycline B et donc la séparation des chromosomes mitotiques et de sortie. Une mauvaise fixation des chromosomes empêche de faire taire SAC signalisation et provoque une inhibition continue de l'APC / C Cdc20 jusqu'à ce que le problème soit résolu pour éviter missegregation chromosomes, aneuploïdie et tumeurs malignes 1.
La plupart des études portant sur les influence de l'attachement chromosomique indue sur APC / C en fonction de la protéolyse a profité de perturbation broche à l'aide dépolymérisation des microtubules ou de stabilisation des médicaments pour interférer avec l'attachement aux microtubules chromosomique. Depuis interférence avec la cinétique des microtubules peut affecter le transport et la localisation des régulateurs critiques, ces procédures comportent un risque d'induire des effets artificiels 5.
Pour étudier comment le SAC interfère avec APC / C-protéolyse dépendante de la cycline B lors de la mitose dans imperturbable populations de cellules, nous avons établi un système d'histone H2-GFP-base qui a permis le contrôle simultané de l'alignement des chromosomes mitotiques en métaphase et la protéolyse de la cycline B 6 .
Pour décrire les profils protéolytiques, nous avons généré une molécule chimérique cycline B journaliste avec un fragment C-terminal SNAP 6 (figure 1). Dans une réaction d'auto-étiquetage, le SNAP-fragment est capable de former des liaisons covalentes avecalkylguanine-supports (substrat SNAP) 7,8 (figure 1). Molécules de substrat SNAP sont facilement disponibles et effectuer un large éventail de différents fluorochromes. Chimères cycline B-SNAP molécules marquées devenir lors de l'addition du substrat de SNAP-membrane perméable au milieu de croissance 7 (figure 1). À la suite de la réaction de marquage, l'intensité cycline B-SNAP fluorescence diminue dans une réaction de type pulse-chase manière intensités de fluorescence et de tenir compte des niveaux de dégradation de la cycline B 6 (figure 1). Notre système facilite le suivi des mitotique APC / C en fonction de la protéolyse dans un grand nombre de cellules (ou plusieurs populations cellulaires) en parallèle. Ainsi, le système peut être un outil précieux pour identifier des agents / petites molécules qui sont capables d'interférer avec l'activité protéolytique à la métaphase anaphase de transition. En outre, comme la synthèse de cycline B lors de la mitose a été récemment suggéré comme un mechanis importantsm dans la promotion d'un bloc mitotique chez la souris et chez l'homme en maintenant les niveaux d'expression de cycline B 9,10 stables, ce système nous a permis d'analyser la protéolyse B cycline comme un élément d'un équilibre harmonieux 6.
Protocol
Discussion
Nous présentons ici une approche imagerie des cellules vivantes basée faciliter la surveillance simultanée de la cycline B protéolyse et l'alignement des chromosomes. Cette approche permet l'étude du contrôle mitotique dans imperturbable populations de cellules au niveau de la cellule unique. Courbes de dégradation des cyclines B faciliter aperçu direct sur l'activité de l'APC / C et donc indirectement refléter l'état de la SAC 6.
Cette approch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à S. Taylor pour assurer la pLPCX-Histone H2-GFP plasmide. Nous remercions R. Mertelsmann pour leur soutien continu. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
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