Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

पूरे सेल आबादी में एकल कोशिका के स्तर पर Cyclin बी के proteolysis अध्ययन

doi: 10.3791/4239 Published: September 17, 2012

Summary

संक्रमण Anaphase Anaphase जटिल (APC / सी) पर निर्भर ubiquitination और cyclin बी के बाद यहाँ विनाश को बढ़ावा देने, हम एक प्रणाली है, जो नाड़ी - पीछा लेबलिंग के बाद स्थापित, पूरे सेल आबादी में cyclin बी proteolysis निगरानी की अनुमति देता है और के माध्यम से शुरू हो रहा है मेटाफ़ेज़ mitotic जांच की चौकी से हस्तक्षेप का पता लगाने की सुविधा है.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. माइक्रोस्कोप चैंबर स्लाइड पर U2OS आधारित Cyclin बी SNAP रिपोर्टर कोशिकाओं (क्लोन 11 प्रकोष्ठों 6) की सीडिंग

  1. Trypsinize subconfluent SNAP संवाददाता कोशिकाओं है कि asynchronously लॉग चरण में कम से कम 48 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई है.
  2. 8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों (कोशिकाओं के निरंतर वितरण) के साथ कार्य करना.

8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों पर कोशिकाओं की खुर्दबीन कक्ष की पूरी सतह, अपकेंद्रित्र 10,000 कोशिकाओं भर में एक निरंतर वितरण और phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 350 μl (10% भ्रूण गोजातीय सीरम पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में बोने resuspend सोडियम और पाइरूवेट). खुर्दबीन चैम्बर (2 चित्रा) सेल निलंबन स्थानांतरण.

8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों (केंद्र में अधिकतम घनत्व सेल) के साथ कार्य करना.

एक उच्च घनत्व पर कोशिकाओं का खुर्दबीन chamb के केंद्र में बोने के लिएएर, phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 300 μl के साथ कक्ष लोड. 5000 कोशिकाओं ध्यान से जोड़ें खुर्दबीन के चैम्बर के केंद्र (2 चित्रा).

96 अच्छी तरह से विशेष प्रकाशिकी प्लेट (कोशिकाओं की निरंतर वितरण) के साथ कार्य करना.

अच्छी तरह से पूरी सतह भर में एक निरंतर वितरण में कोशिकाओं के साथ 96 प्लेटों पर बोने के लिए, 5000 कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 300 μl में resuspend. एक 96 अच्छी तरह से थाली सेल निलंबन स्थानांतरण. सेल युक्त आवश्यक कुओं की कुल संख्या पर निर्भर करता है, सेल नंबर और निलंबन मध्यम (2 चित्रा) की कुल मात्रा समायोजित करें.

96 अच्छी तरह से विशेष प्रकाशिकी प्लेट (केंद्र में अधिकतम घनत्व सेल) के साथ कार्य करना.

कोशिकाओं के साथ 96 प्लेटों पर बोने के लिए, ध्यान phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 15 μl में एक smal में 1,500 कोशिकाओं जोड़नेएल सेल के विकास का प्रतिबंध अच्छी तरह के केंद्र (2 चित्रा) को प्राप्त करने के लिए एक अच्छी तरह से केंद्र के लिए ड्रॉप.

  1. वरीय कोशिकाओं को कम से कम 18 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस, 100% हवा नमी, 5% सीओ 2) के तहत विकसित करने के लिए अनुमति दें.

2. तस्वीर सब्सट्रेट के साथ रिपोर्टर प्रकोष्ठों के धुंधला हो जाना

  1. धुंधला प्रक्रिया की शुरुआत करने से पहले 30 मिनट phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास की aliquots 37 के लिए गर्म करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस
  2. तस्वीर सब्सट्रेट के आसान से निपटने के लिए (हमारे मामले TMR स्टार में) TMR स्टार DMSO में भंग करने के लिए 400 सुक्ष्ममापी स्टॉक समाधान, जो -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है में एक एकाग्रता प्राप्त
  3. धुंधला पहले, phenol लाल मुक्त सामान्य वृद्धि मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) 1 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम लेबलिंग एकाग्रता प्राप्त करने के 200 μl में TMR स्टार स्टॉक समाधान के 0.5 μl पतला.
  4. Asynchronously बढ़ कोशिकाओं से सामान्य वृद्धि मध्यम निकालें और एल में सेते हैंमानक संस्कृति शर्तों के तहत 25 मिनट के लिए मध्यम abeling.
  5. मध्यम और धोने कोशिकाओं phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ चार बार लेबलिंग निकालें. Phenol लाल मुक्त 30 मिनट के लिए सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के 300 μl में कोशिकाओं सेते हैं. पहले माइक्रोस्कोप परिवहन करने के लिए ताजा phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ मध्यम जगह अवशिष्ट अनबाउंड SNAP सब्सट्रेट हटा.
  6. एक पूर्व गर्म पर एक स्टायरोफोम बॉक्स में माइक्रोस्कोप परिवहन कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस) गर्मी तापमान परिवर्तन को कम करने के लिए ब्लॉक.

3. प्रतिदीप्ति तीव्रता का मापन

  1. विश्लेषण करने के लिए पहले दो घंटे 37 ° C सूखी मोड में जलवायु चैम्बर के हवा के तापमान को समायोजित क्रम में वांछित तापमान के लिए अपने सभी घटकों के साथ पूरे माइक्रोस्कोप लाने. पूर्व हीटिंग नमी स्थापित करने से पहले संक्षेपण और बाद खुर्दबीन के लिए क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. हवा में नमी टी समायोजितओ 60% और सीओ 2 से 5% के विश्लेषण के शुरू करने के लिए पहले.
  3. स्कैन ^ आर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू और मानक सेटिंग (1 टेबल देखें) को परिभाषित करें.
  4. कुओं की स्थिति को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण किया जा.
  5. Δt (अधिग्रहण चक्र समय) और अधिग्रहण चक्र की निरपेक्ष संख्या को परिभाषित करें.
  6. यदि कुओं के एक उच्च संख्या के विश्लेषण वांछित है, हार्डवेयर autofocus का चयन करें, अन्यथा यह सॉफ्टवेयर autofocus अकेले इस्तेमाल करने के लिए पर्याप्त है.
  7. अधिग्रहण के आरंभ और पहले दो अधिग्रहण चक्र के लिए की निगरानी. माइक्रोस्कोप histone H2-GFP संकेत पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, उस चैनल में पहली छवि के बाद अधिग्रहण के साथ पहले फिल्टर बदल गया है और इसी TMR स्टार छवि (3 चित्रा) का अधिग्रहण किया है. यह तो एक अच्छी तरह से भीतर और जांच की जा कुओं में से प्रत्येक के लिए सभी पदों के लिए दोहराया है, फिर अगले चक्र दोहरा से पहले,.

4. Proteolytic प्रोफाइल यू के विश्लेषणस्कैन ^ आर गाना

  1. प्रारंभ स्कैन ^ आर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और सेल नाभिक के साथ छवियों का विश्लेषण, के रूप में histone H2 GFP, मुख्य उद्देश्य के रूप में परिभाषित द्वारा visualized, एक संकेत तीव्रता और पड़ोसी कोशिकाओं को अलग करने में सहायता करने के लिए एक जल एल्गोरिथ्म पर आधारित सीमा का उपयोग कर. Cytoplasm के साथ एक नाभिक से मिलकर एक subobject TMRstar विश्लेषण के लिए बनाया जाना चाहिए. (मुख्य उद्देश्य के महत्वपूर्ण गुण एक्स और वाई पदों, समय, और अधिकतम और GFP की मुख्य उद्देश्य और कुल TMRstar subobject के लिए क्षेत्र से विभाजित तीव्रता के लिए तीव्रता मतलब है.) इस विश्लेषण की प्रक्रिया में कई बड़े डेटा की वजह से घंटे लग सकते हैं मात्रा में.
  2. मोड का पता लगाने के लिए subobject मतलब समय पर TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता (सेल निशान), विश्लेषण मुख्य वस्तुओं (4 चित्रा) को सौंपा कल्पना बदलें. जांच की कोशिकाओं की संख्या उन लोगों के कम से कम 140 चक्र स्थायी माप पर gating और H2 GFP की एक उच्च अधिकतम तीव्रता के साथ नीचे संकुचित किया जा सकता है. देख रहे हैंकोशिकाओं की बड़ी संख्या में पहली बार एक प्रतिनिधि और उद्देश्य दृश्य (4 चित्रा) की अनुमति देता है.
  3. एकल कोशिका के स्तर (चित्रा 5A) में histone H2 GFP और TMR स्टार प्रतिदीप्ति एक साथ कल्पना के लिए ब्याज की एक सेल का पता लगाने का चयन करें.
  4. ब्याज की एक सेल पर सही माउस क्लिक का प्रयोग और histone H2 GFP और cyclin बी SNAP हर समय बिंदु के लिए TMR स्टार के चित्रण के लिए एक निर्यात तस्वीर गैलरी उत्पन्न.
  5. स्कैन ^ आर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और गेट क्षेत्र है जहां ब्याज की सेल एक्स बनाम वाई डॉट साजिश (चित्रा 5 ब) पर प्रतिनिधित्व किया है की जनसंख्या मोड में बदलें.
  6. Gated क्षेत्र के लिए एक नया डॉट साजिश विंडो लागू करते हैं और समय के साथ TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 5C) मतलब कल्पना.
  7. Microsoft Excel में निर्यात (समय और प्रतिदीप्ति तीव्रता) आगे की गणना के लिए डेटा.

5. प्रतिनिधि परिणाम

अंजीरure 5D और 5E cyclin बी कैनेटीक्स, एक TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता वक्र द्वारा प्रतिनिधित्व एक सेल के को दर्शाती है, है कि गुणसूत्र misalignment के लक्षण (चित्रा 5E) के बिना एक नियमित रूप से पिंजरे का बँटवारा के माध्यम से आय. परमाणु लिफाफा टूटने (NEBD, के रूप में लाल त्रिकोण से संकेत) के बाद cytoplasm के संघनन पर, TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता एक अचानक वृद्धि से पता चलता है जब तक isomorphic खिड़की (चित्र में उज्जवल क्षेत्र) तक पहुँच जाता है जब सेल 6 prometaphase में प्रवेश करती है. प्रतिदीप्ति तीव्रता prophase और मेटाफ़ेज़ सेल के माध्यम से आय के रूप में लंबे समय के रूप में एक स्थिर स्तर पर बनी हुई है और फिर तेजी से एक बार ड्रॉप शुरू होता है गुणसूत्रों की एक स्थिर मेटाफ़ेज़ प्लेट (चित्रा 5D और 5E) की स्थापना की है. यह ड्रॉप पश्चावस्था (वक्र पर नीला डॉट) के दौरान गुणसूत्र जुदाई पछाड़ दिया है. देर से पिंजरे का बँटवारा में chromatin decondense शुरू होता है (नीले सलाखों) और सेल अंतरावस्था आकारिकी adopts जबकि प्रतिदीप्ति तीव्रता वक्र एक दृष्टिकोणजो पठार पिंजरे का बँटवारा (चित्रा 5D और 5E) से पहले पठार की तुलना में कम है.

तालिका 1. मानक सेटिंग के रूप में cyclin बी proteolysis के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया. Histone H2 GFP एक संदर्भ संरचना के रूप में इस्तेमाल किया गया था बी तस्वीर cyclin प्रतिदीप्ति तीव्रता की माप के लिए ध्यान केंद्रित विमान को परिभाषित करने के लिए. ध्यान केंद्रित प्रक्रिया के दौरान हल्की तीव्रता को कम कर रहे हैं के रूप में छवि अधिग्रहण सेटिंग्स की तुलना में संचयी phototoxicity से बचने के.

चित्रा 1
चित्रा 1. Cyclin बी proteolysis गिरावट अंतर्जात प्रोटीन के लिए इसी तरह की विशेषताओं के साथ एक chimeric cyclin बी व्युत्पन्न की अभिव्यक्ति के माध्यम से की माप के योजनाबद्ध. नाड़ी पीछा लेबलिंग के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में गिरावट APC / सी गतिविधि का एक उपाय है.

चित्रा 2
चित्रा 2. 8 अच्छी तरह से स्लाइड या साथ 96 प्लेटों पर कोशिकाओं के विश्लेषण के नियमित वितरण.अच्छी तरह से सतह भर कोशिकाओं resuspension द्वारा 300 μl की एक अंतिम मात्रा में हासिल की है और सिफारिश की है, अगर केवल एक या कुछ पदों स्वयं विश्लेषण के लिए परिभाषित कर रहे हैं. केंद्र क्षेत्र में कोशिकाओं का संवर्धन कोशिकाओं के प्रीफिल्ड या खाली कुओं के केंद्र के अलावा द्वारा हासिल की है. इस तकनीक अलग कुओं में स्वचालित छवि अधिग्रहण के मामले में सिफारिश की है.

चित्रा 3
चित्रा 3. डाटा अधिग्रहण के अनुक्रम. Histone H2-GFP की) जांच ध्यान केंद्रित विमान परिभाषा और पिंजरे का बँटवारा के दौरान निगरानी गुणसूत्र संरेखण के लिए प्रयोग किया जाता है. बी) TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रतिदीप्ति तीव्रता नाड़ी पीछा cyclin बी SNAP लेबल की पूर्ण राशि के लिए एक उपाय है.

चित्रा 4
चित्रा 4. मतलब TMR स्टार के प्रतिनिधि स्कैन ^ आर सॉफ्टवेयर आधारित विश्लेषण चित्रणसमय पर प्रतिदीप्ति (कुल TMRstar क्षेत्र द्वारा विभाजित तीव्रता) एक प्रतिनिधि सेल ट्रेस (नीला) का चयन तीव्रता. इसी छवियों (सही पर दिखाया गया है) के एक साथ दृश्य की अनुमति histone H2 (हरा) GFP और बी SNAP cyclin (लाल). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5+ बी) XY डॉट साजिश पर ब्याज की एक सेल का प्रतिनिधित्व डॉट्स के gating के लिए उदाहरण है. सी) समय पर मतलब TMRstar प्रतिदीप्ति तीव्रता (कुल TMRstar क्षेत्र द्वारा विभाजित तीव्रता) की विज़ुअलाइज़ेशन डॉट साजिश का उपयोग कर. डी + E) प्रतिनिधि isomorphic NEBD (परमाणु लिफाफा टूटने) और chromatin (नीली पट्टी) के रूप में माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में उत्पन्न decondensation के बीच विंडो (चित्र पर brigher क्षेत्र) के साथ बी SNAP cyclin प्रतिदीप्ति तीव्रता की अवस्था. Anaphase टी ने संकेत दिया हैवह वक्र पर नीले डॉट. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी 1 पूरक फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हम यहाँ एक जीवित कोशिका इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण cyclin बी proteolysis और गुणसूत्र संरेखण के साथ - साथ निगरानी की सुविधा मौजूद है. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है mitotic में नियंत्रण के अध्ययन एकल कोशिका के स्तर पर सेल आबादी बेफिक्र. Cyclin बी गिरावट घटता APC / सी गतिविधि में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि की सुविधा और इस तरह परोक्ष रूप से 6 सैक की स्थिति को प्रतिबिंबित.

यह दृष्टिकोण, भले ही स्कैन ^ आर सॉफ्टवेयर के आधार पर स्थापित है, आसानी से किसी भी तुलना खुर्दबीन स्टेशन पर reproduced किया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे रेट्रोवायरल cyclin बी SNAP अभिव्यक्ति का निर्माण का उपयोग करते हुए, एक संवाददाता सेल लाइन को आसानी से किसी भी वांछित सेल लाइन में स्थिर retroviral एकीकरण के द्वारा स्थापित किया जा. प्रणाली को भी और अधिक लचीला बनाने, chimeric SNAP प्रोटीन विभिन्न fluorochromes के साथ कलंकित किया जा सकता है.

histone निगरानी गुणसूत्र संरेखण, faci में अपनी आवश्यकता के अलावा H2 GFP, कार्यान्वयनतेज और आसान autofocusing litates. Autofocus और तीव्रता सेटिंग्स भी सेल के प्रकार पर निर्भर करती है और प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए स्थापित किया जाना है. इसके अलावा सेल स्कैन ^ आर प्रौद्योगिकी का उपयोग डिवीजनों की बड़ी संख्या के proteolytic प्रोफाइल के अधिग्रहण हमें एकल mitoses, जो गुणसूत्र संरेखण त्रुटियों से पता चला के लिए चयन करने के लिए अनुमति दी. यह हमें न्यायपालिका है और नियमित रूप से 6 डिवीजनों के proteolytic प्रोफाइल के बीच मतभेदों को परिभाषित करने के लिए सक्षम होना चाहिए.

गुणसूत्र misalignment प्रदर्शित mitoses भी कच्चे छवि के ढेर के विश्लेषण से चुना जा सकता है, हालांकि इस समय कुशल कम है. Cyclin बी तस्वीर प्रतिदीप्ति तीव्रता ImageJ जैसे छवि विश्लेषण के लिए फ्रीवेयर प्रोग्राम का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति तीव्रता घटता एक क्षेत्र / गेट mitotic कोशिका (Wolthuis एट अल द्वारा वर्णित तकनीक 11.) को परिभाषित करने के अंदर समय पर मतलब पिक्सेल तीव्रता के आधार पर गणना की जा सकती है. एक isovolumetric विंडो के भीतर है, जो किया गया है का वर्णनघ 6 पहले, आकार और सेल की मात्रा लगभग स्थिर रहते हैं. यह जल्दी पश्चावस्था तक मतलब पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए मैन्युअल prometaphase मेटाफ़ेज़, और जल्दी पश्चावस्था के दौरान cyclin बी proteolysis अनुमान के लिए एक ही क्षेत्र / परमाणु लिफाफा टूटने के बीच गेट का उपयोग करने के लिए एक औचित्य प्रदान करता है.

^ स्कैन आर आधारित दृष्टिकोण का प्रयोग, एकल कोशिका के स्तर में गिरावट विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर Microsoft एक्सेल जैसे, घटता, आगे गणितीय विश्लेषण gating की आवश्यकता है. अभिनव gating रणनीतियों के लिए सभी कोशिकाओं के विश्लेषण स्वचालित डेटा निर्यात की अनुमति देने के पूरे सेल आबादी के एक अधिक समय कुशल विश्लेषण की सुविधा हो सकती है. एक पूरी तरह से स्वचालित दृष्टिकोण सभी सेल निशान को कवर अधिक प्रतिनिधि परिणाम के लिए नेतृत्व, आगे इस तकनीक की शुद्धता को बढ़ाने सकता है और इसलिए mitotic निकास के विनियमन में गहरी अंतर्दृष्टि की सुविधा.

फास्ट और कुशल स्वचालित छवि अधिग्रहण हमारे मॉडल टी के लिए सक्षम बनाता हैओ बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा. यहाँ shRNA पुस्तकालयों का उपयोग कर स्क्रीन उपन्यास mitotic नियामकों की पहचान करने के लिए हो सकता है. इसके अलावा, सिस्टम APC / सी पर निर्भर proteolysis के साथ हस्तक्षेप करने में समसूत्रणरोधी उपचार के लिए उपन्यास दवाओं की पहचान में अपनी शक्ति के संबंध के साथ छोटे अणुओं स्क्रीनिंग में उपयोगी होना चाहिए.

Cyclin बी कैनेटीक्स व्यापक रूप cyclin बी GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता की निगरानी के द्वारा संबोधित किया गया है. यहाँ, हम एक प्रणाली है कि पूरी प्रोटीन अभिव्यक्ति से cyclin बी proteolysis के चित्रण की सुविधा है और इसलिए पिंजरे का बँटवारा 6 क्षेत्र में व्यापक रूप से वितरित की तकनीकों के लिए एक मूल्यवान संशोधन का गठन उपस्थित थे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एस टेलर को pLPCX Histone H2 GFP प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए आभारी हैं. हम निरंतर समर्थन के लिए आर Mertelsmann धन्यवाद. यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Autofocus सेटिंग्स Histone H2 GFP (मुख्य उद्देश्य अधिग्रहण सेटिंग्स) बी SNAP Cyclin TMR स्टार के साथ लेबल
(अधिग्रहण सेटिंग्स)
अधिग्रहण चक्र समय Repetitions
मोटे autofocus / + -39 सुक्ष्ममापी 24 परतें
ठीक autofocus
/ + -5.4 सुक्ष्ममापी 14 परतें
GFP फिल्टर सेट:
एक्स्पोज़र समय: 100 मिसे
हल्की तीव्रता: 25%
TRITC फिल्टर सेट:
एक्स्पोज़र समय: 150 मिसे
हल्की तीव्रता: 33.3%
2 से 5 मिनट.
GFP फिल्टर सेट:
एक्स्पोज़र समय: 12 मिसे
प्रकाश तीव्रता: 12.5%
पर जारी विश्लेषण के 48 घंटे (60% की कम हवा नमी द्वारा सीमित)
Name Company Catalog Number Comments
Reporter cell line generated in-house as described 6 clone 11 reporter cells
(U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector generated in-house as described 6 pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM Gibco 21063-029 Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star New England Biolabs S9105S Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well Costar 3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat Ibidi 80826
Microscopy unit Olympus IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective Olympus UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software Olympus Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software Olympus Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
  2. Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
  3. Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
  4. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
  5. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
  6. Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
  7. Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
  8. Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
  9. Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
  10. Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
  11. Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
पूरे सेल आबादी में एकल कोशिका के स्तर पर Cyclin बी के proteolysis अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).More

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter