Cranial mesenchyme gjennomgår dramatiske morphogenic bevegelser som sannsynligvis gir en pådriver for heving av nevrale folder<sup> 1,2</sup>. Her beskriver vi en enkel<em> Ex vivo</em> Eksplanterer analyse for å karakterisere den cellulære atferd av cranial mesenchyme under neurulation. Denne analysen har mange bruksområder, inkludert å være mottagelig for farmakologiske manipulasjoner og sanntidsavbildning analyser.
Sentralnervesystemet er avledet fra det nevrale plate som gjennomgår en serie av komplekse morfogenetisk bevegelser resulterer i dannelsen av nevralrøret i en prosess kjent som neurulation. Under neurulation, er morphogenesis av mesenchyme som ligger til grunn for nevrale plate antas å drive nevrale fold høyde. Cranial mesenchyme består av paraksiale mesoderm og neural crest cellene. Cellene i cranial mesenchyme danner en pourous meshwork består av stellate formede celler og intermingling ekstracellulære matrix (ECM) tilnærmingene som støtter de nevrale folder. Under neurulation gjennomgår cranial mesenchyme stereotype rearrangements resulterer i utvidelsen og disse bevegelsene antas å gi en pådriver for nevrale fold høyde. Men fortsatt trasé og cellulære atferd som driver cranial mesenchyme morphogenesis dårlig undersøkt. Interaksjoner mellom ECM og cellene i kraniale mesenchyme underliggende these celle atferd. Her beskriver vi en enkel ex vivo eksplantasjon assay utviklet for å karakterisere virkemåter for disse cellene. Denne analysen er amendable til farmakologiske manipulasjoner å dissekere signalveier involvert og sanntidsavbildning analyser til videre karakterisere oppførselen til disse cellene. Vi presenterer et representativt eksperiment demonstrerer nytten av denne analysen for å karakterisere den vandrende egenskaper kraniale mesenchyme på en rekke ECM komponenter.
Nevralrøret nedleggelsen i skallen oppstår mellom embryonale dag 8,5 (E8.5) og 9,5 i musen embryo. Unnlatelse av å lukke nevralrøret i hodet resultatene i anencephaly, en felles strukturelle fødsel defekt hos mennesker og er uforenlig med liv. De kreftene som driver cephalica nevralrøret nedleggelse genereres fra både nervevev selv og omkringliggende epidermis og mesenchyme 3. Spesielt utvidelse av kraniale mesenchyme antas å være avgjørende for heving av den kraniale nevrale folder 1,2. Cranial mesenchyme er rik på ECM proteiner spesielt glykosylert proteiner som heparin sulfat proteoglykaner, chondroitin sulfater og Hyaluronate 4-8.
I motsetning til i kylling embryo der neural crest cellene emigrere fra dorsal nevralrøret etter neural tube nedleggelse, vandrer neural crest i musen embryo på samme tid som de nevrale folder begynner å rise (etter 5 somitt stadiet). Dermed under neurulation i mus embryo, er cranial mesenchyme består av celler avledet fra neural crest og paraksiale mesoderm. Neural crest og paraksiale mesoderm populasjoner er indusert på ulike tidspunkt i utviklingen, lokalisert i ulike posisjoner i embryo og utvikle seg til ulike strukturer 9,10. Den paraksiale mesoderm stammer fra primitive strek og vandrer til fremre delen av embryo til grunn for den presumptive nevrale plate. Neural crest er indusert ved krysset av nevrale plate og epidermal ektoderm, gjennomgår en epitelial å mesenchyme overgang og delaminates like før nevrale fold økning i gnager embryo. Neural crest cellene vandrer langs stereotype baner i subectodermal paraksiale mesoderm til branchial bue, frontonasal og periokulær mesenchyme. Den paraksiale mesoderm vil bidra til noen av beina i skallen hvelvet og muskler i ansiktet, mens the neural crest vil bidra til andre bein i hodeskallen og ansiktet i tillegg til kraniale nerver 9-11. Den paraksiale mesoderm og neural crest linjene kan forskjellig preget av Mesp1-cre og Wnt1-CRE transgene mus linjer, henholdsvis 9.
Avgjørende rolle av den kraniale mesenchyme i nevralrøret nedleggelsen er avledet fra forsøk hvor behandling av gnagere embryoer med ECM forstyrre agenter som hyaluronidase, kondroitinase ABC, heparitinase eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation svekket neural tube nedleggelse 7, 12-14. I disse eksperimentene, avslørte Histologisk analyse av statiske deler etter neurulation knyttet dysmorphogeneis av cranial mesenchyme 7,12-14. Men siden teratogene agenten hadde tilgang til flere vev, gjenstår det å bli bestemt om den kraniale mesenchyme er virkelig målvevet. Til støtte for den konklusjon at dette veveter viktig for neurulation, vises cranial mesenchyme unormal på histologiske analyser i noen mus mutanter med eksencefali 15-17. Likevel, i de fleste tilfeller, har effekten av mutasjonen på cellenivå oppførsel av kraniale mesenchyme ikke blitt adressert.
Vi har utviklet en ex vivo eksplantering analysen til direkte undersøke konsekvensen av genetisk mutasjon eller farmakologisk manipulasjon på oppførselen kraniale mesenchyme celler 15. Denne analysen er lik som publisert av Tzahor et al 2003 for å få tilgang til differensiering potensialet i kraniale mesenchyme som ligger til grunn de rhombomeres 18 bortsett fra vi har endret eksplantering disseksjon å studere trekkende egenskapene flere fremre bestander av cranial mesenchyme som ligger til grunn anterior neural plate. Vår metode er også en modifikasjon av eksplantasjon assays utført i kylling embryo for å analysere trekkadferden av neural crest med key forskjeller. Tidligere forberedelsene har eksplantert neural crest eller mer posterior paraksiale mesoderm 19,20. Videre, under nevrale fold økning i kylling embryo, har neural crest ennå ikke emigrerte fra dorsal nevralrøret og dermed explants tatt av fremre paraksiale mesoderm ikke ville inneholde neural crest cellene. I analysen vår, er cranial mesenchyme explants bestående av paraksiale mesoderm, neural crest og overflate ektoderm forberedt og belagt på et substrat. Eksperimentell manipulasjon inkludert isolasjon av explants fra genetiske mutanter, plating explants på ulike ECM eller farmakologisk behandling kan utføres. Cellene vandrer fra eksplantering og avstand, antall og atferd kan analyseres og sammenlignes mellom behandlingsgruppene. I tillegg er dette preparatet amendable til analyser av cellulær migrasjon av levende avbildningsteknikker. Etter migreringen eksperimentet kan eksplanter være fast og utsettes for immunhistokjemiske analyser til pelsther belyse effekten av behandlinger. I det hele er protokollen som presenteres her en enkel ex vivo-forsøk for å undersøke oppførselen til kraniale mesenchyme. Som en representant eksperiment, bruker vi denne analysen for å undersøke migrasjon av cranial mesenchyme på ulike ekstracellulære underlag.
Metoden anvendt her gir en kraftig assay å undersøke oppførselen av kraniale mesenchyme celler. I tillegg til de statiske analysene som presenteres her, sanntidsavbildning eksperimenter i lyse felt eller i kombinasjon med ekspresjon av GFP-merkede proteiner kan anvendes for å undersøke de virkemåter for celler i sanntid som de migrerer fra eksplantasjon. For live bildebehandling eksperimenter, kan explants merkes med Dii eller å differensiere migrering av neural crest fra paraksiale mesoderm, ROSA-YFP; Mesp1-cre eller ROSA-YFP; Wnt1-cre eller andre transgene linjer kan brukes. Kraniale mesenchyme-ECM interaksjoner kan også bli undersøkt utnytte denne eksplantering analysen. Her vi plate eksplanter på ulike ECM substrater som er tilstede i den kraniale mesenchyme å vise at cellene vandrer på disse til forskjellige grader og at ECM påvirker morfologien av cellene. Videre kan explants være forankret i en tredimensjonal matrise for å få tilgang til atferd av cells i denne sammenheng. Dette eksplantering analysen er amendable til analyse av effekten av genetiske og farmakologiske manipulasjoner på cranial mesenchyme atferd å analysere indre og ytre signaler som kan regulere og endre migrasjon. For eksempel, benyttet vi denne analysen i våre studier for å skjelne rolle overflødig HSP90 sekresjon i de unormale cellene atferd i Hectd1 mutant cranial mesenchyme 15. I disse eksperimentene, behandlet vi eksplanter med anti-antistoff, HSP90 HSP90 protein, geldanamycin og DMA (dimetyl amelioride) for å blokkere utskillelse av HSP90 å demonstrere at den unormale oppførselen Hectd1 mutante celler skyldes overskytende ekstracellulær HSP90 15. Lignende tilnærminger kan brukes til farmakologisk dissekere ytterligere trasé underliggende normal eller unormal morphogenesis av den kraniale mesenchyme. Når analysen er fullført, kan eksplanter og migrerende celler bli analysert av en rekke metoder. For eksempel, immunhistokjemisk analyser cen brukes til å undersøke lokalisering av proteiner kritiske for celle bevegelser. Transkriptom analyser kan også brukes til å bestemme hvordan behandlinger påvirker genuttrykk.
Én betydelig begrensning av denne teknikken er at den ikke modell atferd i tre dimensjoner som de ville oppstå in vivo. Modifisering av protokollen der explants er innebygd i en tredimensjonal matrise (f.eks Matrigel) sammen med uttrykk av fluorescerende protein-merkede cellene kan være ansatt nødvendig for å løse dette problemet. Selv om disse modifikasjoner ble utført, ville ytterligere eksperimenter for å korrelere atferd sett i dette ex vivo-forsøk med de i vivo være nødvendig. Andre begrensninger omfatter det store antall embryoer som kreves for å generere et tilstrekkelig antall for å generere statisk betydelige data. Viktigst er disseksjon relativt enkel, krever det øvelse å mestre.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av R01-HD058629 til IEZ