Summary
هذه التقنية الجراحية يوضح حقن ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية للعين الماوس.
Abstract
فقدان البصر يؤثر على ما يقرب من 3.4 مليون شخص في الولايات المتحدة، ومن المتوقع أن تزداد في السنوات القادمة .. 1 في الآونة الأخيرة، والعلاج الجيني زرع الخلايا الجذعية أصبحت أدوات العلاجية لعلاج العمى الرئيسية الناجمة عن الأمراض التنكسية الشبكية. وقد ولدت عدة أشكال من الزرع الذاتي للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، مثل زرع القزحية الصباغ الخلايا الظهارية، نتائج مشجعة، وتجارب اكلينيكية على البشر بدأت لأشكال أخرى من العلاج بالخلايا الجذعية والجينات .. 2 وتشمل هذه RPE65 استبدال الجينات العلاج في المرضى المصابين بعمى جزئي خلقي وزرع الخلايا RPE باستخدام الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا في أمراض ستارغاردت 3-4 الآن أن هناك ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية المتاحة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض شبكية العين، فمن المهم للتحقق من هذه العلاجات المحتملة في تطبيق النماذج الحيوانية قبلجي لهم في الدراسات البشرية. الماوس أصبح نموذجا هاما العلمية لاختبار الكفاءة العلاجية للناقلات العلاج الجيني وزرع الخلايا الجذعية في العين 5-8 في هذه المقالة الفيديو، نقدم تقنية لحقن ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية من العين الماوس مع تقليل الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها.
Protocol
1. تجميع الأجهزة لحقن تحت الشبكية
- شراء أو تقديم قطرها ميكرون 100 إبرة من أنبوب زجاجي الشعرية. ويمكن أن يتم ذلك يدويا باستخدام سوتر P-97 مجتذب الماصة أو معدات أخرى مماثلة. سيكون ساخنا نهاية الأنبوب الشعري وسحبت حتى تصل إلى القطر المطلوب (100 ميكرون). ويمكن استخدام إبرة أصغر قطر لناقلات العلاج الجيني، ولكن هذا هو قطر الموصى به لحقن الخلايا دون الأضرار التي لحقت الخلايا أو العين. مقارنة الإبر الصلب، الزجاج الإبرة الشعرية لديه معلومات دقيقة جدا، ولكن بصراحة، للسماح لرؤية حقن السائل والوصول إلى الفضاء تحت الشبكية دون أن تسبب الكسر في شبكية العين. تنظيف هذه الإبر سحبت إذا لزم الأمر باستخدام الايثانول 70٪، وتخزينها في وعاء معقم. A 15 سم زراعة الأنسجة المعقمة الطبق مع الشريط لعقد الإبر في مكان واحد الطريقة التي للحفاظ على حقن الإبر وغطت في بيئة معقمة. عند هذه النقطة، كومبلمؤسسة التدريب الأوروبية في انشاء داخل غرفة العمليات الجراحية حيث الإجراء سوف تحدث. فمن الأسهل للحفاظ على جميع المعدات في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات من أجل أن تبقى عقيمة، لا سيما إذا كان ذلك الإجراء داخل مرفق الجدار.
- نضح السيليكون في إبرة حقن السيليكون وإخراج لترك الطلاء على طول الجدران الداخلية للإبرة. طلاء السيليكون يزيد من مرور الخلايا والفيروسات من خلال إبرة تحمل، والتي ستلتزم على نحو آخر مع الجدران الزجاجية الداخلية الشعرية.
- الحصول على ما يقرب من 8 سم طول أنابيب بلاستيكية معقمة من خلال خفض بنسبة 25 جمع الدم ¾ عيار مع مجموعة قفل الأنبوب عند نقطة مباشرة بعد الإبرة (إزالة الإبرة من أنابيب).
- 1 مل ملء الفرعية س 26 5/8-gauge زلة تلميح المحاقن مع ملحي معقم وإزالة الإبرة من الحقنة.
- إبرة حقن إرفاق إلى نهاية قطع من انابيب البلاستيك ونعلق المحقنة إلى الأنبوب قفل في الطرف الآخرنهاية.
- نضح ملحي معقم لملء الفراغ القتلى في الإبرة والأنابيب الشعرية، إخراج بعض المالحة من خلال إبرة لضمان أن يتم إرفاق بشكل صحيح من دون أي تسرب. المقبل، نضح صغير، حوالي 1 ميكرولتر من كمية الهواء، في رأس الإبرة الحقن. وهذا فصل من السوائل المالحة وتوفير الحقن مؤشرا مرئيا تشير إلى نهاية السائل الحقن أثناء إجراء العمليات الجراحية. يجب أن تبقى جهاز الحقن على سطح نظيف محو أسفل مع الايثانول 70٪ خلال إجراء العمليات الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تنظيف جميع المعدات المستخدمة أثناء إجراء العمليات الجراحية قبل وبعد مع الايثانول 70٪، للاستثناء من الإبر الحقن التي يجب أن تبقى عقيمة بالفعل وجاهزة للاستخدام. يجب التخلص من هذه الإبر من بعد الجراحة، وليس إعادة استخدامها
- وأخيرا، نضح حل الحقن التي تحتوي على المطلوب العلاج الجيني الفيروسي ناقلات المعلبة أو الخلايا الجذعية. ويمكن أن يتم ذلك عن طريقتناول الحقن في حل تلميح الماصة المعقمة، ثم pipetting الحل على سطح الخلية طبق الثقافة العقيمة. ويمكن الآن أن يستنشق الحل بسهولة في إبرة الحقن باستخدام محقنة. فإن المبلغ اللازم تختلف تبعا للعمر من الفأرة. لأغراضنا نحن نستخدم ما بعد الولادة 5 أيام الفئران، والتي يمكن حقنها مع 0،5-0،8 ميكرولتر من السائل الحقن. يمكن استخدام كميات صغيرة، 0.5 ميكرولتر أو أقل، ويمكن استخدامها لصغار الفئران ومبالغ أكبر، مثل 1 ميكرولتر، لفئران بالغة. وعيار الفيروسية أو عدد الخلايا بحاجة إلى أن تحدد على أساس خلية / فيروس يتم حقنه وأنسجتهم الهدف المنشود، كما يمكن أن الجسيمات الفيروسية أو الخلايا كثيرة جدا في حجم صغير يؤدي إلى سمية للخلايا الشبكية. في الفيديو، لأغراض التصور، وقد استخدمنا 1،5 ميكرولتر، أكبر كمية من الصبغة مما هو ضروري لحقن في العين.
2. الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية
- داخل غرفة العمليات الجراحية المعقمة،استقرار أو تخدير الماوس وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان وافق محليا، والتي سوف تختلف حسب العمر من الفأرة. التخدير مشتركة لفئران بالغة تتضمن استخدام الغاز أو الحقن isoflurane داخل الصفاق من 0.1 ml/10g وزن الجسم من الكيتامين (100 ملغ / مل) وزيلازين (20 ملغ / مل) في ملحي معقم. لفترة ما حول الولادة الفئران، وتقنيات التخدير شيوعا تشمل استخدام الغاز isoflurane أو تخدير بالبرد (انخفاض حرارة الجسم). يجب الموافقة على جميع تقنيات التخدير من قبل لجنتكم IACUC المحلية قبل الاستخدام. نستخدم عادة بعد الولادة اليوم (P) 5 الفئران، على الرغم من إمكانية تطبيق تقنيات مماثلة لالفئران في سن P0 أو لفئران بالغة. يمكن إجراء العمليات الجراحية لم يبدأ حتى الماوس توقف تحريك أطرافه ولم يعد يستجيب إلى أخمص القدمين القرصات. لفترة ما حول الولادة الفئران، فإنها تصبح أخف وزنا بشكل ملحوظ في اللون منذ تدفق الدم سوف تبطئ، مفتاح آخر لمعرفة أنهم تحت التخدير الكامل.
- في فترة ما حول الولادة الفئران، استخدم مقص Vannas مباشرة إلى مأك تقريبي شق 1.5 مم على طول الشق غطاء مغلقة. كن حذرا لخفض المسافة البادئة في، حيث سيتم فتح العين بشكل طبيعي في المستقبل. هذا يضمن أن الأغطية سوف تلتئم بشكل صحيح وفتح أثناء وضع الماوس. ويمكن استخدام شفرة جراحية لهذا الغرض، على الرغم من أننا نفضل مقص Vannas لأنها تقلل من خطر ثقب العين خلال هذا الإجراء. في الفيديو، استخدمت مقص لقطع ثقب مباشرة وعلى طول هامش الجفن. عندما تعلم هذه التقنية، يجب استخدام ملقط لرفع الجفن قبل القطع والحد من مخاطر الإضرار بالعين.
- مزق الجفون مع ملقط خلع الملابس منحنية لproptose العين والجفون قرصة قليلا تحت العين لأنه عقد proptosed للحقن. إذا شق غطاء المحرز في الخطوة الثانية هي كبيرة جدا، وسوف تنزلق العين تحت الجفن ومنع التعرض الكافي أثناء إجراء الحقن. لفئران بالغة، وتطبيق ضغط خفيف حول العين مع الدكتوريمكن essing ملقط الاستمرار على العين proptosed للحقن.
- جعل شق صغير في الصلبة أو الخلفي لخط الاستواء في العالم من خلال خدش سطح بشفرة المجهرية 15-درجة. وهذا ينبغي أن تكون كبيرة شق ما يكفي فقط لتمرير غيض من إبرة الحقن، ولكن لم أكبر من ذلك. إذا فضلت، يمكن استخدام صغيرة، إبرة حادة مثل الإبر الوخز بالإبر لجعل هذا شق في الفضاء تحت الشبكية بدلا من شفرة المجهرية. في الحيوانات المصطبغة نحو مظلم، مظلم والبني المصطبغة الأنسجة (الشبكية والمشيمية ظهارة الصباغ) تصبح مرئية عند نقطة شق. في أخف الفئران مصطبغة أو البيضاء، يمكن تطبيق قلم الجراحية بمناسبة لغيض من شفرة المجهرية لترك بقعة الحبر تشير إلى موقع شق. إذا اضحة refluxes السائل (زجاجي) من موقع شق، وضعت شفرة عميق جدا ودخل تجويف الجسم الزجاجي وفيروس العلاجية أو الخلايا قد تدخل الفضاء intravitreal خلال الحقن. لvisualizatiعلى الأغراض، وجعلنا من شق إلى هذه النقطة في الفيديو. لا يزال من الممكن لإكمال الحقن تحت الشبكية في هذه الحالة، ومع ذلك يجوز للانفصال الشبكية الناجم عن وجود حقن السائل لا شفاء تماما في هذا الماوس. ولذلك، يجب الحرص على قطع فقط السطح الخارجي للعين وليس من خلال شبكية العين قبل الحقن.
- إدراج بعناية الإبرة الحقن في موقع شق ودفعها موازية لجدار العين الخارجي لدخول الفضاء تحت الشبكية. وسوف تقدم قريبة جدا من الجدار الخارجي أو عميق جدا داخل العين توجيه الحقن في موقع خاطئ. أفضل طريقة لفهم ما إذا كانت الإبرة في الموقع الصحيح لممارسة هذه التقنية. يمكن ممارسة على الفئران البيضاء أو فاتح اللون تساعد على جعل حقن دقيقة ودقيقة في الفضاء تحت الشبكية. وذلك لأن السائل إبرة الحقن ومرئيا داخل هذه العيون.
- تطبيق الضغط الخفيف على المكبس حقنة ويكونحقن الجن من السائل المطلوب. إذا ما وضعت بشكل صحيح الإبرة داخل الفضاء تحت الشبكية، سيتم شعرت احداهما معتدلة. إذا كانت الإبرة داخل الجسم الزجاجي، وسيكون هناك أقل بكثير احداهما وربما بعض الجزر السوائل أثناء الحقن. إذا كان هناك احداهما كبيرة، أمسك إبرة في المكان لمدة لا تقل عن 15 ثانية إضافية قبل إزالة الإبرة ببطء. وهذا سوف يسمح ارتفاع الضغط داخل العين لادراك التعادل بدلا من refluxing الفيروس حقن الخلايا أو العودة إلى موقع شق. ويمكن حقن بعض الهواء والمياه المالحة في الفضاء تحت الشبكية بسبب زيادة الضغط المطلوب أثناء إجراء الحقن. وينبغي الحرص على عدم الإفراط في ضخ الهواء أو المالحة، لأنها يمكن أن طرد الفيروس حقن الخلايا أو من العين. ومن الممكن أيضا أن يسبب انفصال الشبكية دائمة من وجود الكثير من السوائل تحقن في الفضاء تحت الشبكية. لأغراض التصور، تم حقن الصبغة الزائدة وكثافة العمليات الجويةيا الفضاء تحت الشبكية في الفيديو. يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح كيف سيتم مسح بعض الصبغة مرة أخرى للخروج من الفضاء تحت الشبكية إذا تم حقن الكثير، ولكن أيضا كيف أن تبقى فقاعة الهواء داخل الفضاء تحت الشبكية و لا تختفي في الجسم الزجاجي. وقد استخدم هذا التأكيد على أن هذه الحقن كانوا جميعا داخل الموقع الصحيح للعين، لذلك يمكن للمرء أن يتخيل كيف أن تدخل الإبرة في موقع شق. جميع الحقن في الفضاء تحت الشبكية يؤدي إلى انفصال الشبكية مؤقتة بسبب وجود السائل الحقن. إذا تم الانتهاء من إجراء الحقن بشكل صحيح، وهذا انفصال الشبكية مؤقتة شفاء في غضون 24 ساعة والفئران يمكن استخدامها لجميع التجارب الأخرى. العين قد تبقى لينة لمدة أسبوع تقريبا بسبب العملية الجراحية، ولذلك يجب تجنب حقن الثانية خلال هذه الفترة من الزمن.
- بالنسبة للفئران حديثي الولادة، ملقط خلع الملابس استخدام المنحني برفق لدفع العين مرة أخرى وراء الأغطية وإلى المدار. قد يكون من المفيدالانتظار لمدة دقيقة وذلك للسماح للفيروس لتسوية في غضون تحت الشبكية وليس التسبب في مسح بها للموقع عند الضغط بلطف شق العين مرة أخرى إلى مداره. بعد الجراحة، قطرة واحدة من بوبيفاكايين 0.5٪ (marcaine) المخفف إلى 0.25٪ في ملحي معقم من إبرة قياس 25-يمكن وضعها في موقع الحقن. الفئران لا تظهر علامات الشدة العلني بعد الجراحة تحت الشبكية واستخدام بوبيفاكايين كمسكن طويل المفعول الموضعية كانت وافرة للسنوات الثلاث السابقة. وينبغي دائما أن تراقب الفئران بعد العملية الجراحية للبحث عن أي علامات الضائقة؛ مثل العدوى، وتورم، أو انخفاض في الأنشطة اليومية المعتادة من الفأرة. إذا حدث وحصل، ينبغي إخطار الطبيب البيطري ويمكن إعطاء عقاقير مضادة للألم مثل البوبرينورفين مزيد (0.05 مغ / كغ) كما حقنة داخل الصفاق.
- تنبيه الفار من التخدير المعتمدة محليا وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان. يجب أن تبقى الماوس على ع التدفئةإعلان للحفاظ على درجة حرارة الجسم طبيعية لأنه يستيقظ من التخدير. يجب إجراء العمليات الجراحية تستغرق أقل من خمس دقائق لإكمال، من دون وقت للخضوع الماوس التخدير. لذلك، وسادة التدفئة ليس من الضروري أثناء إجراء الفعلية، ولكن قد تكون هناك حاجة في حين واحد هو تعلم تقنية والإجراء قد يستغرق مدة أطول من الزمن. لا ينبغي أن توضع الماوس مرة أخرى إلى قفص نظيفة حتى بدأت التحرك من تلقاء نفسها. لحديثي الولادة، والقرصات إصبع لطيف لمساعدة تستعد عافيتها بشكل كامل من التخدير، ويجب أن تستعيد لونها الوردي وحركة قبل وضعها مرة أخرى مع الأم. وينبغي رصد الفئران بمرور الوقت عن أي علامات الضائقة كما هو موضح سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد الرسم من العين الفأر مع الهياكل الرئيسية مرقوم للإشارة، مع السهام عرض المواقع لإجراءات حقن كل intravitreal وتحت الشبكية الجراحية (النصال، الشكل 1). ويمكن حقن العلاج الجيني النواقل، مثل ناقلات lentiviral lacZ (الشكل 2)، وذلك باستخدام هذه المواقع. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا الخلايا الجذعية، مثل الخلايا الجذعية الجنينية (الشكل 3)، أن زرع في هذه المواقع في العين الماوس.
تم حقن 1 ميكرولتر من ناقلات lentiviral تحمل الجين مراسل lacZ يقودها المروج (CMV) الفيروس المضخم للخلايا (1x10 8 TU / مل، Lentigen شركة، الشكل 2A) في الفضاء تحت الشبكية من الفئران C57BL/6J. ومنزوعة النواة عيون في ستة أسابيع من العمر بالتسليخ الكليل ومنغمسين في 1 حل X-غال ملغ / مل (K 3 5MM الحديد (CN) 6، 2 ملم MgCl 2، 0.02٪ NP 40، و 0.1٪ من الصوديوم deoxycholate) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. كانت ثابتة في عيون 2٪ غلوتارالدهيد formaldehyde/0.2٪ لمدة 30 دقيقة ومقطوع على مشراح. LacZ التعبير الجيني مراسل والكشف عن X-غال المنتج (الأزرق) في حوالي 10٪ من خلايا مستقبلة للضوء (الشكل 2B). وجود الخلايا التعبير lacZ والأنسجة المحيطة سليمة تشير إلى نجاح الحقن تحت الشبكية في العين الماوس.
وصفت C57BL/6J الماوس الجذعية الجنينية (ES) مع خلايا البروتين الفلوري الأخضر (EGFP، معهد يلكوم ترست سانجر). ثم تم جمع هذه الخلايا وعلقت في معقمة الفوسفات مخزنة المالحة وزرعها في الفضاء تحت الشبكية من يوم ما بعد الولادة (P) 5 C57BL/6J الفئران، مع ما يقرب من 5 خلايا 1x10 حقن لكل 1 ميكرولتر. ومنزوعة النواة في عيون أسبوعين من العمر من قبل تشريح حادة، والثابتة في التدرج السكروز والمجمدة في المتوسط تضمين أكتوبر (الأنسجة تيك). كانت عينا مقطوع وفيما تحت المجهر مضان ualized (زايس). ويمكن الاطلاع على وجود-GFP المسمى خلايا ES داخل الفضاء تحت الشبكية للعين الماوس حقن (الشكل 3A). بالإضافة إلى ذلك، تم electroporated C57BL/6J-Tyr C-2J / J (C2J) الماوس الجذعية الجنينية (ES) الخلايا مع بروتين فلوري الصفراء (YFP) ومتباينة في الخلايا الصبغية (RPE) الظهارية في شبكية العين في المختبر. بعد شهر واحد من التمايز، علقت YFP التي تحمل علامات RPE مثل الخلايا الجذعية الجنينية في C2J العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة وحقنها في الفضاء تحت الشبكية من الفئران C57BL/6J P5. في 15 أسابيع من العمر، وكان الماوس تصور باستخدام التصوير الحية تألق ذاتي لوجود YFP داخل شبكية العين (Spectralis منظار العين المسح الضوئي ليزر متحد البؤر، هايدلبرغ الهندسة، الشكل 3B).
4286fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. التخطيطي للعين الماوس. A رسم الكارتون المسيئة للهياكل من العين الفأر مع مواقع لإجراءات حقن كل intravitreal وتحت الشبكية وضع علامة (النصال).
الشكل 2. تحت الشبكية حقن الجين ناقلات الفيروسية العلاج. A. خريطة ناقلات الفيروسة البطيئة تظهر الجين مراسل lacZ يقودها المروج (CMV) الفيروس المضخم للخلايا. B. التعبير عن الجينات مراسل lacZ في شبكية العين في الفأر ستة أسابيع بعد الحقن القديم C57BL/6J تحت الشبكية في ما بعد الولادة لمدة خمسة أيام. RGC، وخلايا الشبكية العقدة؛، INL طبقة داخلية النووية؛ IS، شرائح مبصرة الداخلية (السهم)؛ قل، طبقة النووي الخارجي (المستقبلات الضوئية) (رأس السهم)؛ OS، شرائح مبصرة الخارجي.
المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. تحت الشبكية الجنينية حقن خلايا فأر (ES) الجذعية. A. A 2 الماوس الأسبوع C57BL/6J القديمة بعد الحقن تحت الشبكية من الفلورسنت الأخضر البروتين (GFP)-ES الخلايا المسمى في ما بعد الولادة لمدة خمسة أيام. GFP إيجابية الخلايا مرئية في غضون تحت الشبكية للعين باستخدام المجهر مضان حقن (زايس). الأخضر، GFP-ES الخلايا المسماة (الأسهم)؛ RGL، طبقة الشبكية العقدة؛، INL طبقة داخلية النووية؛، قل الخارجي طبقة النووي (المستقبلات الضوئية)؛ IS / OS، شرائح مبصرة الداخلي والخارجي؛ RPE، ظهارة الصباغ الشبكية. B. A 15 الاسبوع الماوس C57BL/6J القديمة شبكية العين باستخدام أظهرت تألق ذاتي الحية التصوير (Spectralis منظار العين المسح الضوئي ليزر متحد البؤر، هايدلبرغ الهندسة) عن وجود بروتين فلوري الصفراء (YFP)-صفت RPE مثل الخلايا ES الماوس C2J داخل شبكية العين.تم إجراء الحقن تحت الشبكية من خلايا YFP-ES-RPE مثل في ما بعد الولادة لمدة خمسة أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية الفيديو يقدم تعليمات على استكمال إجراءات الحقن تحت الشبكية الجراحية بنجاح، وضمان أن يتم وضع ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الموقع اللازمة لعلاج هذا المرض بكفاءة العيون. هذا الأسلوب يسمح للاستهداف خلايا الشبكية مثل RPE أو خلايا مستقبلة للضوء، لأنه يضع ناقلات العلاج الجيني أو أنسجة الخلايا الجذعية المشتقة من على مقربة من هذه الخلايا. الطرق السابقة تشارك الحقن intravitreal، حيث يتم وضع السائل داخل تجويف الجسم الزجاجي ويجب ترحيل من خلال الشبكية من أجل استهداف هذه المناطق المحددة. حقن Intravitreal يقلل من تنبيغ ناقلات العلاج الجيني أن خلايا مستقبلة للضوء الهدف أو RPE، منذ ليس كل الجسيمات الفيروسية سوف يهاجر إلى الموقع الصحيح. وعلاوة على ذلك، الخلايا الجذعية تزداد شعبية لتحل محل RPE مريضة أو المستقبلات الضوئية، ويجب زرع هذه الخلايا المتمايزة داخل اللجنة الفرعيةالشبكية الفضاء .. 5
الخطوة الحاسمة في هذا الإجراء هو دخول الفضاء تحت الشبكية، لأن هذا يضمن الموقع الصحيح من ناقلات العلاج الجيني أو أنسجة الخلايا الجذعية المستمدة من أجل الحصول على الكفاءة العلاجية، جنبا إلى جنب مع الحد من احتمال انفصال الشبكية أو تلف في العين المحيطة الأنسجة. يجب توخي الحذر لاستكشاف في وقت مبكر؛ لتكون قادرة على تحديد مكان وحقن السوائل في الفضاء تحت الشبكية. ويمكن أن يتم هذا من خلال الممارسة باستخدام الصبغة الملونة والفئران البيضاء، كما هو موضح في الفيديو، منذ إبرة الحقن لن تكون مرئية داخل العين من الفئران مصطبغة. بعد الممارسة، فإن الباحث تعلم لنرى الفرق في الضغط بشكل صحيح عندما يتم وضع السائل داخل الفضاء تحت الشبكية وتكون مريحة مع إجراء العمليات الجراحية لإتمامها في الوقت المناسب.
هناك بعض التعديلات المحتملة لهذا الإجراء الجراحي. يمكن أن تؤدي هذه الحقنإد على الفئران من مختلف الأعمار، على الرغم من أن كمية ناقلات العلاج الجيني أو أنسجة الخلايا الجذعية المشتقة من حقن يمكن أن تختلف تبعا لعمر من الفأرة. وينبغي الحرص على تحديد مقدار السوائل سوف تعزز العلاج لهذا المرض العيني، ولكن ليس إطالة مفرزة وتلف في الشبكية. يمكن تعديل الإبرة سحبت شعري أن يكون بأقطار مختلفة. أصغر الإبر لحقن كافية الفيروسية، ولكن أكبر أقطار قد يكون من الأفضل لزرع الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الجراحة على الفئران البالغة. كثافة نسيج العين سوف تكون أكبر من ذلك بكثير، هي المطلوبة، حتى الطازجة حادة شفرات جراحية لتخترق الفضاء تحت الشبكية. في جميع الحالات، يمكن إجراء تعديلات بناء على هذا البروتوكول لإكمال نجاح الحقن تحت الشبكية من الجين ناقلات العلاج أو الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة.
وجميع الحقن تحت الشبكية يؤدي إلى انفصال الشبكية مؤقتة بسبب وجود حقن السائل داخلتحت الشبكية الفضاء، ولكن هذا يجب أن مفرزة تلتئم في غضون 24 ساعة من إجراء العمليات الجراحية. يمكن فحصها بدقة الفئران تحت المجهر لأي مفرزة المتبقية. فمن الممكن أن بعض الفئران قد لا تلتئم بشكل طبيعي حتى بعد الحقن في وضع جيد. جميع الفئران قادرة على الخضوع لفحص والتجارب التالية هذه الفترة لمرة وعلى مدار 24 ساعة، ولكن العين قد تكون لينة بسبب تغيير في ضغط من إجراء الحقن لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ولذلك، واحدة من القيد هذه التقنية هي القدرة على أداء الحقن الثانوي خلال الأسبوع ما بعد الجراحة الأولى. حقنة أخرى قد لا يكون من الممكن خلال فترة ما بعد الجراحة مباشرة، حيث يتم زيادة نسبة حدوث انفصال الشبكية التي لا شفاء بعد الجراحة. ينصح إلى الانتظار لمدة أطول من الزمن، ما دام شهر واحد، قبل إعادة حقنه في العين الماوس.
أصبح الماوس كائن حي نموذجا هاما لدراسة مرض العيون والعلاجات المحتملة رسوف يؤدي إلى قبعة تجارب اكلينيكية على البشر. 9-12 والقيد الثاني من هذا الإجراء هو أن تقاس ليس كل الخلايا مع ناقلات DNA بعد الحقن تحت الشبكية، لأنها ستكون في نموذج الفأر المعدلة وراثيا. ومع ذلك، قد يكون هذا الإجراء على نحو أوثق تقريبي إجراء السريرية في البشر لا تقاس حيث كل خلية. وهكذا، يمكن أن تساعد هذه التقنية لإنشاء جدوى لناقلات العلاج الجيني الفيروسي أو زرع نسيج الخلايا الجذعية المشتقة من العلاج لعلاج سن المتصلة تحلل البقعة الصفراء والأمراض الأخرى الشبكية والسائل الزجاجي في البشر. يمكن للتطبيقات المستقبلية تشمل استخدام مختلف المروجين خلايا شبكية والخلايا الجذعية متباينة، أو الحقن متعددة حتى باستخدام مزيج من العلاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بحث للوقاية من العمى، والمساعدة التجريبية من ناغازاكي تاكايوكي؛ هذا البحث يتفق مع بيان أرفو لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث البصرية. ويدعم KJW من المنح والمعاهد الوطنية للصحة 5T32EY013933 5T32DK007647 20-. ويدعم VBM من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08EY020530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
- Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
- Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
- Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).
- Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89, 911-919 (2010).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).
- Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One. 6, e189992 (2011).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R.
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).
