Summary
Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te meten
Abstract
Een groeiende doel op het gebied van metabolisme is het effect van genetica bepalen op verschillende aspecten van mitochondriale functie. Inzicht in deze relaties zal helpen om de onderliggende etiologie voor een reeks van ziekten die verband houden met de mitochondriale dysfunctie, zoals diabetes en obesitas te begrijpen. Recente ontwikkelingen in instrumentatie, heeft de controle van verschillende parameters van mitochondriale functie in cellijnen of weefselexplantaten. Hier presenteren we een methode voor een snelle en gevoelige analyse van mitochondriale functie parameters in vivo tijdens zebravis embryonale ontwikkeling met behulp van de Seahorse bioscience XF 24 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol gebruikt de Islet Capture microplaten wanneer een embryo geplaatst in elk putje, waarmee metingen van bio-energetica, waaronder: (i) basale ademhaling, (ii) basale mitochondriale respiratie (iii) mitochondriale respiratie door ATP omzet, (iv) mitochondriale afgekoppeld ademhaling of proton lek en (iv) een maximale ademhaling. Met behulp van deze benadering embryonale zebravis ademhaling parameters kunnen worden vergeleken tussen wild-type en genetisch veranderde embryo's (mutant, gen overexpressie of gen knockdown) of die farmacologisch gemanipuleerd. Verwacht wordt dat de verspreiding van dit protocol zullen de onderzoekers te voorzien van nieuwe tools om de genetische basis van metabole aandoeningen in vivo in deze relevante gewerveld dier model te analyseren.
Protocol
Deel 1: Chemische behandeling van zebravis embryo's
- Verzamel zebravis embryo na de bevruchting. Incubeer bij 28,5 ° C in E3 medium in 100 x 15 mm petrischalen. Opmerking: Voor in situ hybridisatie of Oil Red-O-kleuring is 1-fenyl-2-thioureum (PTU) in een eindconcentratie van 0,2 mM toegevoegd remmen pigmentvorming, 1 maar is niet noodzakelijk Seahorse analyse.
- Voor farmacologische studies, voegt de gewenste chemische stof in een geschikte eindconcentratie de ontwikkeling zebravis embryo op ongeveer 26 uur na de bevruchting (HPF) met een geschikt vehiculum alleen Aanwijzing:. Voor lichtgevoelige farmacologische remmers, embryo's kunnen ontwikkelen in het donker voor analyse.
Deel 2: Live Metabole Profiel Met behulp van de Seahorse XF 24 Analyser
- Voor elke run, de Seahorse XF 24 Analyser cartridge die de O 2 en H huisvest
- Voorbereiding van de 24-well XF 24 eilandje plaat. De volgende experimentele sequentie wordt toegepast:
- Aangezien zuurstofverbruik is gevoelig voor temperatuurschommelingen worden vier wells gebruikt om te controleren op mogelijke temperatuurschommelingen over de plaat. Deze putjes bevatten geen embryo, maar gevuld met 700 ul E3 medium (Figuur 2A).
- De resterende 20 putjes (zie paragraaf 2.2) gevuld met 700 pl medium E3 en een embryo elke (Figuur 2B).
- Voor elk experiment worden 10 embryo's behandeld met vehikel alleen (controle) en 10 behandeld met chemische remmer (bewerkt). Controle en behandelde embryo's worden afgewisseld (bv ook A2: controle embryo; zowel A3: behandelde embryo: goed A4: controle embryo; zowel A5 behandeld embryo, enz.).
- Een eilandje vastlegscherm toegevoegd bovenop. elk putje dat de specimen blijft in de meetkamer in de assay (figuur 2B) Opmerking: chemisch behandelde embryo's blijven de oorspronkelijke chemische oplossing gedurende de gehele procedure, zonder de noodzaak om de spoelen voor het uitvoeren van de chemische analysator Seahorse programma.
- Eenmaal klaar wordt de plaat geplaatst in de Seahorse Analyser en de test wordt gestart.
- Analyse. Twee verschillende assays routinematig uitgevoerd.
- Basal ademhaling / Maximum ademhaling programma (duur ca.. 90 min.). Veranderingen in basale ademhaling ondersteunen metabole dysfunctie, terwijl maximale ademhaling is een maat van de totale energie productiecapaciteit en veranderingen in deze parameter geassocieerd met een aantal zowel pathologische en fysiologische toestanden. De reservecapaciteit respiratoire capaciteit of het vermogen van het systeem verder te verhogen ATP productie, eveneens berekendvan deze test door het aftrekken van basale door maximale ademhaling. Drie herhalingen van elke mix (2 min) / wait (1 min) / meting (2 min) cyclus wordt uitgevoerd om eerst basale ademhaling. Aan het einde van de derde cyclus is een eindconcentratie van 2,5 uM van FCCP (mitochondriale protonophore / ontkoppeling) aan elk putje toegevoegd waardoor de meting van maximum ademhaling. De meetcyclus wordt vervolgens herhaald 5 tot 8 maal (Figuur 3).
- ATP omzet / Proton lek programma (duur ca.. 60 minuten). Ademhaling te wijten aan ATP omzet is de belangrijkste functie van mitochondriën in de vorm van ATP productie, terwijl de ademhaling als gevolg van proton lek, of ontkoppeld ademhaling, is onlosmakelijk verbonden met de andere parameters van mitochondriale functie inclusief basale ademhaling en reactive oxygen species formatie. Ademhaling door ATP omzet wordt vertegenwoordigd door het verschil in ademhaling na toevoeging van 25 uM oligomycine (een remmer van eenTP synthase) in vergelijking met basale ademhaling. Ontkoppelde ademhaling, ademhaling of door proton lek wordt bepaald als het verschil tussen oligomycine gemedieerde ademhaling en ademhaling na toevoeging van 25 uM rotenon (a complex I inhibitor). Meetcycli worden herhaald 8 keer na toevoeging van elke mitochondriale inhibitor.
- Voorbereiding van de 24-well XF 24 eilandje plaat. De volgende experimentele sequentie wordt toegepast:
Aan het einde van de runs, gemiddelde van de 10 controle en 10 chemisch behandelde embryo's worden berekend.
Deel 3: Olie-Red-O kleuring
- Embryo bij 50 hpf worden dechorionated met fijne forceps en gefixeerd in 4% PFA overnacht bij 4 ° C.
- Oil Red-O-kleuring uitgevoerd zoals eerder beschreven 2 (zie figuur 4).
Representative Results
Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de rol specifieke genen op de stofwisseling, met name ademhaling en vetstofwisseling. Daarom hebben we wildtype zebravis embryo's behandeld vanaf 26 hpf ingang met een specifieke farmacologische inhibitor enzym gecodeerd door een van deze genen. Op 50 HPF helft van het voertuig en remmer behandelde embryo's werden geanalyseerd met de Seahorse voor mitochondriale functie, terwijl de andere helft gefixeerd in 4% PFA overnacht bij 4 ° C en vervolgens gekleurd voor lipide depositie met Oil Red-O-. Behandeling met de specifieke remmer geleid a ~ 2-voudige toename van de basale ademhaling (figuur 4A), gepaard gaande met een toename van lipide depositie name in de grote hersenen en onder de otic vesicle (figuur 4B, C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van chemische behandeling van zebravis embryo's. Wildtype, genetisch gemanipuleerd of farmacologisch behandeld zebravis embryo achtergrond.
Figuur 2. XF24 eilandje plaat opzetten. (A) Vier putten embryonale medium bevatten alleen als temperatuurregeling (gemarkeerd met een X) en de anderen bevatten een embryo / goed. (B) Close-up van een goed (C6) met een 50 hpf wild-type embryo behandeld met voertuig (DMSO) gedekt door een eilandje capture scherm (pijlpunt).
Figuur 3. Respiration parameters voor wild-type 50 hpf zebravis embryo's. (A) Voor elke meting wordt het gemiddelde van de 20 individuele embryo's gepresenteerd. Basale ademhaling (Mean: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), Maximale ademhaling (Mean: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), Spare Respiratory Capaciteit (Mean: 87.7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Voor elke meting wordt het gemiddelde van de 20 individuele resultaten gepresenteerd. Basale mitochondriale respiratie; mitochondriale respiratie als gevolg van ATP omzet; mitochondriale ontkoppeld ademhaling en niet-mitochondriale respiratie. Mt: mitochondriale; SRC: Spare Respiratory Capaciteit; SD: Standaarddeviatie, SEM: standaardfout van Mean. De resultaten worden gepresenteerd in pmol van O 2 verbruikt / min / embryo. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Reprerepresentatieve resultaten van chemische blootstelling aan basale ademhaling en lipide depositie. (A, B) 50 hpf embryo gekleurd met Oil Red O-in zijaanzicht. De embryo geïncubeerd met het selectieve inhibitor (B) toont meer Oil Red-O-kleuring in de grote hersenen (pijlpunt) en onder de otic vesicle (pijl) vergeleken met een vehikel behandelde controlegroep embryo. (C) toont een Basal ademhaling ~ 2 voudige toename in chemisch behandelde embryo's (n = 10 embryo's per groep). Resultaten worden weergegeven in pmol van O 2 / min / embryo.
Discussion
De zebravis is een gevestigde genetisch model voor zowel vooruit (ENU mutagenese) en achteruit (Tilling, zinkvinger nuclease gerichte knock-out, morfolino knock-down) genetische benaderingen 3,4, terwijl genfunctie in zebravis embryo's kunnen ook eenvoudig worden geblokkeerd of geactiveerd met selectieve farmacologische verbindingen die specifiek zijn voor de gecodeerde producten. Vanwege hun externe ontwikkeling en klein, zebravis embryo's zijn bijzonder geschikt voor metaboolanalyse. Echter, robuuste meting van metabole profiel en mitochondriale functie in vivo in zebravis embryo's niet zijn bereikt, met slechts een voorlopige beschrijving gerapporteerd 5. Seahorse analyse werd oorspronkelijk ontworpen voor cel-gebaseerde metabole studies is aangetoond om nauwkeurige en betrouwbare resultaten 6. De toepassing van deze nieuwe methodologie om zebravis embryo's is significant en waarschijnlijk de bredere gebruik van dit model voor metabole studies te vergroten.
In deze studie tonen we aan het meten van een aantal van de ademhaling parameters in zebravis embryo's met behulp van de Seahorse Analyser, met inbegrip van basale ademhaling, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit, ATP omzet en proton lekkage. Wij ook een voorbeeld van hoe deze metingen gecorreleerd worden met fysiologische parameters, in dit geval lipide accumulatie en het gebruik van farmacologische remmers in dit testsysteem. In combinatie met het gebruik van genetisch veranderde embryo's, biedt dit een krachtig experimenteel platform voor het begrijpen van factoren die van invloed op de stofwisseling.
Er zijn verschillende toepassingen voor deze nieuwe methodologie met mitochondriale dysfunctie geïmpliceerd in veel menselijke ziekten, zoals diabetes mellitus 7, obesitas 8, 9 multiple sclerose, ziekte van Parkinson 10 van Alzheimer 11 en een soort van kanker 12. Belangrijker our werkzaamheden worden uitgevoerd in vivo, waar alle omgevingsinvloeden - zoals cytokinen, ontwikkelingsgerelateerde groei etc - actief, waardoor een fysiologisch relevant beeld in vivo ademhaling en metabole profiel. Als chemische schermen ook routinematig uitgevoerd in wild type en mutante achtergrond zebravis embryo's (Figuur 1) nieuwe geneesmiddelen die invloed ademhaling, mitochondria functie of metabolisme kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met de Seahorse analyzer. De resultaten die met de Seahorse analyzer kan worden gebruikt in combinatie met andere assays om aanvullende informatie. Dit kan onder fysiologische analyse, zoals olie-kleuring of moleculaire analyse, zoals in situ hybridisatie voor specifieke adipocyte markers zoals cebpα, PPARa, PPARy, FAS etc.
Er zijn nog een aantal beperkingen aan deze methode. Hoewel wij en anderen waren in staat om oligomycine gebruiken om maatreure ATP productie en proton lek op jonge embryo 5 (zie figuur 3), in embryo's ouder dan 60 hpf oligomycine behandeling is inefficiënt. Wij zijn van mening dat bij oudere embryo's oligomycine niet kan diffunderen zo gemakkelijk dan bij jongere embryo's maken van de resultaten onmogelijk te interpreteren. Omdat de oligomycine resultaten zijn verplicht voor de bepaling van de ademhaling als gevolg van ATP omzet en afgekoppeld ademhaling, zijn we momenteel onderzoek naar hogere concentraties van oligomycine voor oudere embryo's. Echter antimycin A behandelingen effectief blijven langer met andere metingen, zoals basale ademhaling, ademhaling maximum & vrije ademhalingscapaciteit kan worden uitgevoerd in oudere zebravis embryo tot 68 hpf (niet getoond).
Een andere beperking in het gebruik van de huidige Seahorse Analyser setup is de fysieke ruimte binnen elk eilandje capture plaat goed, zodanig dat ze alleen geschikt zijn voor zebravis embryo's en jonge larven. Daarom zal het uitvoeren MetabolIC studies op dieet geïnduceerde obesitas bij volwassen vissen, bijvoorbeeld technisch nog niet haalbaar. Dit kan echter studie vraagt de ontwikkeling van platen speciaal ontworpen voor jeugd of volwassen vissen, waardoor het toepassingsgebied van analyses mogelijk.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de medewerkers van de Deakin University zebravis Facility bedanken voor het verstrekken van uitstekende lopende houderij zorg. YG wordt ondersteund door een Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship en een Central Research Grant van Deakin University. SLM wordt ondersteund door een NHMRC Career Development Fellowship. ACW wordt ondersteund door een NHMRC inschakelen Grant. Alle auteurs worden ondersteund door de Molecular & Medical Research Strategic Research Centre van de Deakin University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
