Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi
Summary
Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.
Abstract
Izozimlerinin protein kinaz C (PKC) ailesi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler içinde yer almaktadır. Bizim son veriler PKC mitokondriyal fonksiyon ve hücresel enerji durumunu düzenler göstermektedir. Sayısız raporlar PKC-a ve PKC-ε aktivasyonu iskemik kalp ve aracılık kardiyoproteksiyon mitokondriyal fonksiyonu iyileştirir olduğunu göstermiştir. Buna karşılık olarak, PKC-α ve PKC-ε böbrek hücrelerinde nephrotoxicant bağlı mitokondriyal işlev bozukluğu ve hücre ölümü ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, PKC izozimleri seçici aktive veya oksidatif fosforilasyon ve hücre canlılığı düzenleme rollerini belirlemek için inhibe edilebileceği aktif mitokondrial fonksiyonları koruyarak böbrek hücrelerinin in vitro modeli geliştirmektir. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) primer kültürlerinde mito mitokondrial solunum ve faaliyet sonucu geliştirilmiş koşullarında kültüre edildiin vivo RPTC ile benzer chondrial enzimler. Geleneksel transfeksiyon teknikleri (lipofektamin, elektroporasyon) primer kültürlerinde verimsiz ve mitokondriyal fonksiyon üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğundan, PKC-ε mutant cDNAlarının adenoviral vektörlerin aracılığıyla RPTC teslim edildi. % 90'ın üzerinde kültür RPTC aktarılmasının Bu yaklaşım, sonuç.
Burada, PKC-ε rolünü değerlendirmek için yöntemler mevcut: 1. mitokondriyal morfolojisi ve ATP sentezi, ve 2 ile ilişkili fonksiyonların düzenlenmesi. Primer kültür RPTC yaşama. PKC-ε eksprese yapısal olarak aktif PKC-ε mutant tarafından aktive edilir. PKC-ε eksprese tarafından PKC-ε ve inaktif mutant inhibe edilir. Mitokondrial fonksiyonu, solunum kompleksleri ve faaliyetleri solunum zincirinin bütünlüğünü solunum incelenerek değerlendirilir F 0 F 1-ATPaz, ATP üretim hızı ve ATP içeriği. Solunum birhal 3 (fazlalık substrat ve ADP varlığında maksimum solunum) ve bağlantısız olarak solunum digitonin-permeabilize RPTC içinde ssessed. Solunum zinciri bütünlüğü izole mitokondrilerde solunum zincirinin dört komplekslerin faaliyetleri ölçülerek değerlendirilir. Oksidatif fosforilasyon Kapasitesi F 0 F 1-ATPaz ATP üretim hızı ve etkinliği, mitokondrial membran potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. RPTC Enerji durum hücre içi ATP içeriğinin belirlenerek değerlendirilir. Canlı hücrelerde mitokondri morfolojisindeki MitoTracker Kırmızı 580, özellikle mitokondri biriken floresan boya ve canlı monolayers bir floresan mikroskop altında incelenir kullanılarak canlandırılmaya çalışılır. RPTC canlılığı Anneksin V / apoptoz ve oncosis belirlemek için flow sitometri ile takip propidium iyodür boyama kullanılarak incelenmiştir.
Bu yöntemler, bireysel PKC izozimleri seçici bir aktivasyon / inhibisyonu için izin vermekin vitro olarak çoğaltılabilir fizyolojik ve patolojik durumlarda çeşitli hücresel fonksiyonları rollerini değerlendirmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yaklaşım renal proksimal tübül hücrelerinin birincil kültür içinde PKC izozimleri bireysel ekspresyonu için olanak sağlar. Bu yaklaşımın birçok güçlü yanları vardır: 1. Bu çeşitli hakaretler (iskemi, hipoksi, oksidatif stres), ilaçlar ve böbrek içinde nephrotoxicants için birincil hedef hücreler (renal proksimal tübüler hücreler) homojen bir nüfus düzenleyici mekanizmaları araştırmak için izin verir. 2. Iyileştirilmiş koşullarda primer kültür yetiştirilen RPTC in <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet Enstitüsü, Sindirim ve Böbrek Hastalıkları, 2R01DK59558 (GN) bir hibe ile desteklenmiştir. Araştırma Kaynakları hibe UL1 RR029884 Sağlık Ulusal Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen UAMS Dönüştürülebilir Araştırma Enstitüsü UAMS az Flow Sitometri Çekirdek kısmi finansmanını sağladı. Biz teşekkür Dr Peipei Ping (Los Angeles California Üniversitesi, Los Angeles, CA) cDNA PKC-ε ve Dr Allen Samarel (Loyola Üniversitesi Tıp Merkezi dominant negatif (inaktif) mutant kodlama taşıyan adenovirüs bir kısım sağlamak için; PKC-ε ve yapısal olarak aktif mutantı kodlayan adenoviral vektör bir alikotu sağlamak için Maywood, IL). Biz de Drs ederim. PKC-ε yapısal olarak aktif cDNA kodlama sağlamak için Peter Parker ve Peter Sugden (Imperial College London, Londra, İngiltere).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
