Summary
Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.
Abstract
Izozimlerinin protein kinaz C (PKC) ailesi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler içinde yer almaktadır. Bizim son veriler PKC mitokondriyal fonksiyon ve hücresel enerji durumunu düzenler göstermektedir. Sayısız raporlar PKC-a ve PKC-ε aktivasyonu iskemik kalp ve aracılık kardiyoproteksiyon mitokondriyal fonksiyonu iyileştirir olduğunu göstermiştir. Buna karşılık olarak, PKC-α ve PKC-ε böbrek hücrelerinde nephrotoxicant bağlı mitokondriyal işlev bozukluğu ve hücre ölümü ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, PKC izozimleri seçici aktive veya oksidatif fosforilasyon ve hücre canlılığı düzenleme rollerini belirlemek için inhibe edilebileceği aktif mitokondrial fonksiyonları koruyarak böbrek hücrelerinin in vitro modeli geliştirmektir. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) primer kültürlerinde mito mitokondrial solunum ve faaliyet sonucu geliştirilmiş koşullarında kültüre edildiin vivo RPTC ile benzer chondrial enzimler. Geleneksel transfeksiyon teknikleri (lipofektamin, elektroporasyon) primer kültürlerinde verimsiz ve mitokondriyal fonksiyon üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğundan, PKC-ε mutant cDNAlarının adenoviral vektörlerin aracılığıyla RPTC teslim edildi. % 90'ın üzerinde kültür RPTC aktarılmasının Bu yaklaşım, sonuç.
Burada, PKC-ε rolünü değerlendirmek için yöntemler mevcut: 1. mitokondriyal morfolojisi ve ATP sentezi, ve 2 ile ilişkili fonksiyonların düzenlenmesi. Primer kültür RPTC yaşama. PKC-ε eksprese yapısal olarak aktif PKC-ε mutant tarafından aktive edilir. PKC-ε eksprese tarafından PKC-ε ve inaktif mutant inhibe edilir. Mitokondrial fonksiyonu, solunum kompleksleri ve faaliyetleri solunum zincirinin bütünlüğünü solunum incelenerek değerlendirilir F 0 F 1-ATPaz, ATP üretim hızı ve ATP içeriği. Solunum birhal 3 (fazlalık substrat ve ADP varlığında maksimum solunum) ve bağlantısız olarak solunum digitonin-permeabilize RPTC içinde ssessed. Solunum zinciri bütünlüğü izole mitokondrilerde solunum zincirinin dört komplekslerin faaliyetleri ölçülerek değerlendirilir. Oksidatif fosforilasyon Kapasitesi F 0 F 1-ATPaz ATP üretim hızı ve etkinliği, mitokondrial membran potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. RPTC Enerji durum hücre içi ATP içeriğinin belirlenerek değerlendirilir. Canlı hücrelerde mitokondri morfolojisindeki MitoTracker Kırmızı 580, özellikle mitokondri biriken floresan boya ve canlı monolayers bir floresan mikroskop altında incelenir kullanılarak canlandırılmaya çalışılır. RPTC canlılığı Anneksin V / apoptoz ve oncosis belirlemek için flow sitometri ile takip propidium iyodür boyama kullanılarak incelenmiştir.
Bu yöntemler, bireysel PKC izozimleri seçici bir aktivasyon / inhibisyonu için izin vermekin vitro olarak çoğaltılabilir fizyolojik ve patolojik durumlarda çeşitli hücresel fonksiyonları rollerini değerlendirmek.
Protocol
1. Birincil Kültür Böbrek proksimal tübüllerde İzolasyonu
- Tavşan, tüketim hem böbrekleri anestezisi ve bir laminer akış kaputu steril hazırlık tampon (DMEM/F12 orta) ile dolu bir Petri kabı koyun.
- Steril 50 mL ve ardından prep tamponu ve 50 ml her bir böbrek serpmek salin, pH 7.4 (PBS) fosfat-tamponlu, ve PBS-demir oksit çözeltisi (45 ml + 5 ml) eklenmiştir. Böbrekler De-capsulate ve deferoksamin içeren hazırlık tampon aktarabilirsiniz.
- Her böbrek korteksi Harvest.
- 15 ml Dounce homojenizer kullanılarak doku homojenize edilir. 1 L'lik steril kabı üzerine yerleştirilen 2 steril elekler (alt 85 mm ve üstünde 235 mikron) üzerinde homojenat dökün. Deferoksamin içeren tampon ile elekler durulayın.
- Deferoksamin içeren tampon 35-40 ml dolu steril bir konik santrifüj tüpüne 85 mikron elek üzerinde kalan doku toplayın. Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın.
- Güçlü bir m yerleştirinboru dış agnet glomerül dolu demir kaldırmak ve süspansiyon yerleşmek izin. Pasteur pipeti kullanarak mıknatısın demir aspire. Bu işlemi tekrarlayın.
- Kollajenaz I ve deferoksamin içeren tampon içinde çözünmüş 0,6 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü 2,400-2,500 üniteleri içeren sindirim orta 1 ml hazırlayın. Sindirim orta filtre sterilize.
- 40 ml hücre süspansiyonu ses seviyesini ayarlama ve sindirim orta 1 ml ekleyin. 17 dk hafifçe 4, 2 dakika için 50 ° C x g, santrifüj süspansiyon karıştırma, oda sıcaklığında inkübe edilir, orta aspire ve taze tampon deferoksamin ekleyin.
- Tekrar demir kaldırma mıknatıs ile birkaç kez prosedür, tekrar aşağı süspansiyon dönmeye orta aspirat ve hiçbir glukoz içeren orta 46 ml ekleyin.
- Yavaşça karıştırın ve iki önceden tartılmış Eppendorf tüpleri içine süspansiyon 500 ul dışarı ölçmek. 1 dakika boyunca 10.000 xg'de hücreleri aşağı Spin, medya aspire ve pelet tartmak. Islak kütle ve protein toplam verim hesaplayın.
- 1 mg protein / glukoz içermeyen DMEM/F12 ortamı kullanılarak çanak yoğunlukta, steril 35 mm kültür tabaklarında Levha hücreler. 37 ° C (% 95 hava /% 5 CO2) de kuluçka makinesi içinde bir orbital çalkalayıcı üzerinde daima 2 ml glikoz serbest DMEM/F12 ortamında kültive hücreler. 1,2
2. Böbrek Proksimal tübül Hücre Kültürü
- Kültür ortamı 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, 6 mM laktat (pH 7.4, 295 mOsmol / kgh ile takviye edilmiş DMEM ve Ham fenol kırmızı, pirüvat ve glikoz olmadan F-12 besleyici karışımı 50:50 karışımı, bir 2 O). Ortam L-askorbik asit 2-fosfat (50 uM), bovin insülini (10 nM), insan transferin (5 mg / ml), hidrokortizon (50 nM), ve selenyum (5 ng / ml) hemen önce ilave edilir günlük ortam değişikliği.
- Bir steril tekniği kullanarak yemekler eski medya aspire. Bir steril tekniği kullanarak her yemeğin sıcak, taze medya 2 ml ekleyin. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) kaplama sonra yaklaşık 5-6 gün içinde izdiham ulaşmak. 1,2
3. RPTC ve adenoviral enfeksiyonu
- Adenoviral enfeksiyon günlük ortam değişikliği RPTC arasında birleşmiş, hareketsiz kültürleri yapılmaktadır. Baskın negatif PKC-ε mutant (dnPKC-ε) yerini tarafından inşa edildi: 1) ATP-bağlayıcı sitesi ve pseudosubstrate etki 2) pozisyonunda glutamat ile alanin 159 pozisyon 436 az arginin ile lisin. Bu mutasyonlar PKC-ε ve aktif konformasyonunu değiştirmeden yapı kinaz aktivitesini yok. 3 PKC-ε inhibe pseudosubstrate etki artıkları 154-163 silinmesini tarafından yapısal olarak aktif yapıldı. 4
- PKC-& epsil önemli bir artışla sonuçlanan enfeksiyon istenen çokluğu (İB) elde etmek için her yemeğin için caPKC-ε cDNA ya dnPKC-ε cDNA taşıyan adenovirüs stok solüsyonu ekleyinüzerine; protein düzeyleri. 24 saat boyunca adenovirüs ile RPTC inkübe edin. Başka bir 24 saat boyunca medya ve kültür hücreleri değiştirin. Fosforlu ve fosforlanmamış toplam PKC-ε proteinlerinin önemli ölçüde daha yüksek düzeyde adenoviral vektör caPKC-ε kodlama bölgesinin 25-50 İB kullanılarak elde edilebilir. Aktif PKC-ε düzeylerinde daha büyük artışlar Büyükşehir İB sonuçlar, ancak hızlı hücre ölümü ve kaybı nedeniyle RPTC tavsiye edilmez. Inaktif PKC-ε proteinin önemli ölçüde daha yüksek düzeyde yan etkilerine neden olmaksızın RPTC içinde İB 50-100 kullanılarak elde edilebilir. 5
- Enfeksiyondan sonra 48 saatte, aspirat medya, PBS ile monolayers yıkayın ve PKC-ε protein düzeylerini belirlemek için immunoblotting analiz için hücreleri toplamak. 5
4. RPTC Solunum Ölçümü
- 3 durum, solunum (120 mM KCI, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO4, ve 2 mM EG ölçmek için bir tahlil tampon hazırlanmasıTA, pH 7.4). Karmaşık bir çiftli durum 3 solunum ölçmek için, 5 mM glutamat, 5 mM malat ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Kompleks II-eşli 3 durum, solunum için, 10 mM süksinat, 0.1 uM rotenon, ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Kompleks IV-3 solunum çiftli durum için, 1 mM askorbat, 1 mM N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD), ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Bir 37 ° C su banyosu içinde çözüm yerleştirin.
- RPTC monolayer içeren bir kültür çanak medya aspire, sıcak bir devletin 3 solunum tampon 2 ml ekleyin, hafifçe bir lastik polis kullanarak çanak hücreleri kazıyın ve Clark-tipi elektrot ile donatılmıştır oksijen tüketimi odasına süspansiyonu aktarın.
- Ölçü durum 2 solunum (ADP yokluğunda). 0.4 mM nihai bir konsantrasyona ADP ilave edilerek 3 durum, solunum başlatın. Nihai concentr için oligomycin ekleyerek devletin 4 solunumu başlatın0.5 mg / ml 'lik tirme. Bağlanmamış solunum durum 3'te soluyarak hücreleri için 0.5 uM FCCP eklenmesi ile ölçülür. 6,7
- , Odasından gelen hücre süspansiyonu toplayın perklorik asit kullanarak protein çökelti, ve çökelti, aşağıya doğru dönerler. Hücresel pelet protein konsantrasyonu tayin edilir.
5. Mitokondriyal Membran Potansiyeli Analizi (ΔΨm)
- Steril kültür ortamı içinde JC-1 çözeltisinin 0.5 mM hazırlayın.
- 5 uM nihai konsantrasyon elde etmek için her bir tabak için JC-1 çözeltisinin yavaş yavaş 20 ul ekle. Swirl çanak iyice boya karıştırmak için. 30 dakika inkübatöre yemekleri dönün.
- Buz, aspirat medya yemekleri koyun ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez monolayers yıkayın. Aspirat PBS, taze PBS 1 ml ekleyin çanak hücreleri kazıyın ve bir Eppendorf tüp aktarabilirsiniz. Onları pipetleme ve aşağı tarafından tek hücre içine monolayers kadar Break.
- 2 dk, asp için 1000 xg'de süspansiyon aşağı Spinsüpernatant kızgın, pelet PBS 1 ml ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yeniden askıya. Gerekirse yeniden bu adımı yineleyin.
- 2 dakika boyunca 1.000 xg'de hücreleri aşağı Spin, süpernatant aspire PBS 0.5 ml ekleyin ve pelet yeniden askıya. Bir 488-nm argon-iyon lazer uyarma kullanılarak akış sitometri ile floresans analiz edin. İki ayrı kanal, 590 nm 525 nm FL1 ve FL2 yılında emisyon okuyun. Mitokondrial membran potansiyeli FL2/FL1 flüoresans oranı olarak ifade edilir. 6
6. Mitokondri İzolasyonu
- Izolasyon tamponlar hazırlamak: Tampon A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 0.1 mM EGTA, pH 7.4), Tampon B (tampon A ihtiva eden proteaz inhibitörleri, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF) ve Tampon C (10 mM HEPES, 395 mM sükroz, 0.1 mM EGTA, pH 7.4). Buz üzerinde tüm adımları uygulayın.
- Buz gibi soğuk PBS ile iki kere RPTC mono tabakalar yıkayın. Eppendorf tüpleri içine monolayers kazıyın ve onları sıkma5 dakika boyunca 500 x g. Tampon A 1 ml pelet yıkayın
- Tampon B, 1 ml pelet yeniden askıya ve 2 ml Dounce homojenizatörü ile süspansiyon aktarın.
- Bir mikroskop altında kontrol zaman Homojenat hücrelerin en bozulana kadar Dounce homojenizatörü içinde hücreler homojenize edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüje homojenat 4'te süpernatant toplayın ve 10 dakika boyunca 15.000 xg'de aşağı spin ° C
- Süpernatant atılır ve Tampon C, 1 ml 4, 10 dakika için 15,000 x g süpernatan aşağı spin topak ihtiva eden ham mitokondri yeniden askıya ° C. Pelet iki kez yıkama tekrarlayın. 5
- Solunum kompleksleri faaliyetleri ölçmek için, sıvı azot deney tamponu ve dondurma 50-100 ul mitokondriyal pelet yeniden askıya. Buz üzerinde yavaş örnekleri çözülme.
7. NADH-ubikinon oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks I)
- 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl2, pH 7.2: tahlil tampon hazırlayın. Sırasıyla, son konsantrasyon% 0.25 'lik ve 0.25 mM elde etmek için serbest yağ asidi-BSA ve NADH ekleyin. 2 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona antimycin A çözeltisi (1 mg / ml), 2 ul ekle.
- 48 sıra şeffaf plaka örnekleri çalıştırın. Tüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örnek sayılabilir. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tampon 500 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C'de inkübe edilir plaka.
- Her kuyucuğa 3.25 mM ubikinon 10 ul ekleyerek reaksiyonu başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (340 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa rotenon çözelti 5 ul (1 mg / ml) eklenir ve ek bir 2 dakika daha absorbansı. Rotenon duyarlı NADH oksidasyonu gibi kompleks I aktivitesinin hesaplayın. 7
8. Süksinat-ubikinon oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks II)
9. Ubiquinol-sitokrom c oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks III)
- Siyanür% 0.1 serbest yağ asidi-BSA, 80 mM potasyum sukkinat, 10 ug / ml rotenon, ve 0.24 mM potasyum ihtiva eden tahlil tampon hazırlayın.
- Örnekler çalıştırmaTüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örneği de dahil olmak üzere 48 sıra şeffaf plaka tekrarlardaki. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tampon 291 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C'de inkübe edilir plaka.
- Her kuyucuğa sitokrom c okside 6 mM 3 ul ekleyerek reaksiyonu başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (550 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa antimycin A çözeltisi (1 mg / ml), 5 ul ilave edin ve 2 dakika süre ile ilave absorbansı. Antimycin A duyarlı sitokrom c redüksiyonu. 7 gibi karmaşık III aktivitesi hesaplama
10. Sitokrom Oksidaz Faaliyet Ölçümü (Kompleks IV)
- Sitokrom c 9 mM'lik bir çözeltisi, sodyum askorbat ekleme ve fosfat tampon oda sıcaklığında 1 litre ° C (10 mM KH 2 PO 4, pH 7.2) 5 mM MgCl2 içeren 4 gece boyunca diyaliz solüsyonu ile sitokrom c azaltılmış hazırlanması. Içeren deney tamponu hazırlayın% 0.1 serbest yağ asidi-BSA ve antimycin A (2 ug / ml).
- Tüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örneği de dahil olmak üzere 48 sıra şeffaf plaka örnekleri çalıştırın. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tamponu, 233 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C'de inkübe edilir plaka.
- Indirgenmiş sitokrom c (90 uM son konsantrasyon) ilavesiyle tepkime başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (550 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa KCN solüsyonu 2 ul (8 ug / ml) ekleyin ve 2 dakika için başka absorbansı. KCN duyarlı sitokrom c oksidasyon gibi kompleks IV aktivitesini hesaplayın. 7
11. F 0 Aktivitenin Ölçümü F 1-ATPaz (ATP sentaz)
- F 0 hazırlayın F 1-ATPaz tahlil tamponu (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8.2). Deney tamponu mitokondriyal pelet yeniden askıya, Liqui mitokondriyal örnekleri dondurmad azot ve yavaş yavaş buz örnekleri eritin.
- Bir 48-kuyu saydam plaka, kopyalardaki örneklerde çalıştırın. Her tedavi grubu için, 2 kuyu kuyu (275 ul oligomycin duyarsız ATPaz aktivitesini ölçmek için toplam ATPaz aktivitesi (tahlil tampon 275 ul, 5 ul mitokondriyal süspansiyon, ve% 95 etanol 5 ul) ve 1 ölçmek için çalıştırmak olacaktır tahlil tamponu, 5 ul mitokondriyal süspansiyon, ve 1 mg /% 95 etanol içinde çözelti oligomycin ml) 5 ul.
- Sürekli sallama ile 10 dakika için 31 ° C 'de örnekleri inkübe edin. 100 mM ATP çözeltisi (pH 7.0) 16 ul ekle ve sürekli sallama ile 5 dakika süreyle 31 ° C'de inkübe edin.
- 3 M TCA 50 ul ihtiva eden bir tüp için inkübasyon karışım 200 ul aktarın. 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe örnekleri, 4, 5 dakika boyunca 10,000 x g'de aşağı dönüş ° C. Sırasıyla, fosfat ve protein içeriği belirlemek için süpernatan ve pelet kullanın.
- Kullanarak Süpernatantları fosfat içeriği belirlemeinorganik fosfat tayini. SO 4 3.75 0.88 g FeSO 4 ila 10 ml MH 2 ekleyerek ve H 2 O ile 90 ml'ye ayarlayarak Sumner Reaktif 100 ml hazırlayın H 2 de FeSO 4 solüsyonuna 4 SO amonyum molibdat çözeltisi (0.66 g/10 ml H2O) 10 ml ilave edilir. Işıktan koruyunuz.
- Ve çiftleri her süpernatan 50 ul - Her fosfat standart 50 ul (1.000 uM KH 2 PO 4 0) ile Yük 96-plaka. Her bir kuyucuğa Sumner reaktifi 250 ul ekle ve sürekli sallama ile 15 dakika için 30 ° C sıcaklıkta inkübe edilir plaka.
- Oda sıcaklığında, 595 nm 'de absorbans kaydedin. F 0 F 1-ATPaz aktivitesi, daha önce tarif edildiği gibi ATP P i oligomycin-duyarlı serbest bırakma ölçülmesi ile tespit edilir. 7,8 toplam hesaplama ve oligomycin-duyarsız F 0 F 1-ATPaz aktiviteleri. Oligomycin duyarlı ATPaz acti hesaplamak içinvite, toplam ATPaz aktivitesi gelen oligomycin-duyarsız aktivite çıkarın. 8,9
12. Hücre içi ATP İçerik Ölçümü
- Sıra kültür buz üzerinde RPTC monolayers içeren yemekler, aspirat orta ve buz PBS tamponu ile iki kez monolayers yıkayın. Her monolayer 1 ml PBS ekleyin, PBS içine her monolayer kazımak ve bir Eppendorf tüp hücre süspansiyonu toplamak. 5 saniye mikrofuge'de içinde Eppendorf tüpleri Spin.
- ATP Biyoparlaklık Test Seti HS II (Roche) ve üreticinin protokolü kullanılarak lusiferaz yöntemiyle her RPTC örnek ATP içeriği belirleyin. Her örnek protein konsantrasyonu tayin ve mg protein başına ATP konsantrasyonu. 8 hesaplamak
13. Mitokondriyal Morfoloji Görselleştirme
- Kültür ortamı değiştirin. Her yemeğin (son kons. 100 nM) için MitoTracker Kırmızı 580 100 uM solüsyonu 2 ul ekleyin ve incubato için yemekler dönmek30 dakika için r.
- Bir su immersiyon objektif kullanarak bir floresan mikroskop altında canlı monolayers inceleyin. 5
14. Hücre canlılığı analizi
- Deneye başlamadan önce 24 saat de apoptozis için pozitif kontrol (Anneksin V-pozitif hücreler) olarak görev yapacak hücrelerin tedavisinde sisplatin 50 mM solüsyon hazırlanır. Ayrıca, oncosis için pozitif kontrol (propidium iyodür-pozitif hücreler) olarak görev yapacak hücreleri tedavi etmek için ters-butylhydroperoxide 500 mM solüsyon hazırlanır.
- 50 mM sisplatin ve tert-butylhydroperoxide 500 mM 2 ul 2 yemekler 2 ul 2 yemekler tedavi edin. No-leke kontrolü için 1 tabak Adamak.
- Sisplatin ile tedavi TBHP ve sonra 24 saat olarak, bağlayıcı tampon hazırlamak (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2) ile propidyum iyodür (PI) çözeltisi (50 mg / ml) bağlayıcı tampon içinde.
- Bağlama tutkunu ile bir kez monolayers yıkayıner. Buz gibi soğuk tampon 1 ml ve no-leke ve Anneksin V-pozitif hücreleri hariç her yemeğin PI çözümü 50 ul ekleyin. Yemekler Kapak ve nazik orbital sallama ile 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
- Bağlayıcı tampon (10 dakika) ile mono tabakalar yıkayın ve bağlayıcı tampon, 1 ml ve hiç leke ve PI-pozitif hücreleri hariç her bir tabak için Annexin V-FITC solüsyonu 2 ul ekleyin. Yemekler Kapak ve nazik orbital sallama ile 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Tampon aspire ve yumuşak orbital sallama ile 10 dakika için buz üzerinde buz-soğuk bağlama tamponu ile 1 ml mono tabakalar yıkayın. Yıkama adımı yineleyin.
- Bağlayıcı tampon aspire ve her bir tabak için bağlayıcı tampon 500 ul ilave edin. Yavaşça bir lastik polis kullanarak hücreleri kazıyın ve sitometrisi tüpleri akmasına hücreleri aktarmak. Örnekler yukarı ve aşağı pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtılır. Herhangi bir hücre kümeleri kadar Break.
- Flo tarafından hemen PI ve Anneksin V-FITC floresans sayısalw sitometri sırasıyla, PI ve FITC için 590 ve 530 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon kullanarak. Her numune için 10.000 olayları sayın.
- X ekseni ve flow sitometri nokta arsa rakamlar Y ekseni üzerindeki PI floresans üzerine FITC floresans koyun. PI Annexin V için pozitif ve negatif hücreler apoptotik kabul edilir. Annexin V PI için pozitif ve negatif Hücreler onkotik kabul edilir. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 gösteriyor ki adenoviral teslimat RPTC ve mitokondri PKC-ε önemli ölçüde artmış protein düzeyleri PKC-ε sonuçları yapısal olarak aktif (caPKC-ε) ve inaktif (dnPKC-ε) mutantlar kodların cDNA. Hücreleri inaktif oldu cDNA kodlama dnPKC-ε aşırı ekspresyona PKC-ε (fosforile değil) (Şekil 1) ile enfekte ise caPKC-ε vektörü taşıyan cDNA ile enfekte hücreler PKC-ε ve fosforile (aktif) şeklinde aşırı eksprese. Aktif varlığı, PKC-ε PKC-ε inaktif hiçbir etkisi yoktur (Şekil 2) elde ederken, mitokondri enerji vermek için kullanılan malzemeye bağlı kalmaksızın RPTC içinde mitokondriyal solunum azalmıştır. Solunum zinciri içinde PKC-ε aktif hedefleri belirlemek amacıyla, solunum zincirinin bütün enzimatik komplekslerinin aktiviteleri tespit edilmiştir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, (Şekil 4) artış ile ilişkili bulunmuştur. Bu değişiklikler, F 0 aktivitesi azalma eşlik etmektedir F RPTC aşırı miktarda aktif PKC-ε (Şekil 5A) izole mitokondri içinde 1-ATPaz (ATP sintaz). Sonuç olarak, RPTC eksprese olan ATP aktif içerik PKC-ε (Şekil 5B) azalmıştır. PKC-ε sürdürülmesinin aktivasyon mitokondriyal parçalanma (fisyon) (Şekil 6B) uyararak mitokondriyal morfolojisi üzerinde derin etkileri olmuştur. PKC-ε aktivasyonu, fakat inhibisyonu, aynı zamanda, bir çekme hücre neden RPTC morfolojik değişiklikler ile sonuçlanmıştır kalan hücrelerin nd uzaması. RPTC eksprese Mitokondriyal disfonksiyon ve mitokondriyal morfolojisinde değişimlere PKC-ε aktif oncosis ve apoptosis (Şekil 7) hem hücre ölümü eşlik etti. 48 saatte adenoviral vektör doğumdan sonra, RPTC eksprese PKC-ε aktif yaklaşık% 50'si canlı değildi. PKC-ε ve inaktif formu aşırı ekspresyonu mitokondriyal fonksiyon ve morfolojisi üzerinde etkisi vardı ve RPTC canlılığı üzerine.
Bu nedenle, PKC cDNA kodlama farklı izozimlerinin adenoviral teslim böbrek hücrelerinin birincil kültürleri içinde bireysel PKC izozimleri ve bunların aktif ya da pasif mutant VEGF'nin sağlayan etkili bir araçtır. Primer kültür yetiştirilen hücreler verimli transfeksiyon için ve farklı hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde eğitim için ve protein kinazlar tarafından hücre morfolojisi ve canlılık değerlendirmesi için olanak sağlar.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Fosforile (aktif) PKC-ε Protein düzeyleri (p-PKC-ε) ve hücre homojenatlarında PKC-ε toplam (sol panel) ve mitokondri (sağ panel) taşıyan adenovirüs vektörü ile enfekte RPTC primer kültürlerinde üreme adenoviral vektör doğumdan sonra farklı zaman noktalarında PKC-ε arasında yapısal olarak aktif (caPKC-ε) veya inaktif mutantlar (dnPKC-ε). Β-aktin düzeyleri ve F 0 F 1-ATPaz hücresi homojenatlarında ve mitokondri, sırasıyla jel yükleme kontrol olarak kullanılır. Şekil Nowak ark güncellenmiştir. 5
Şekil 2. DevletRPTC 3 ve bağlantısız solunum adenoviral doğum sonrası 48 saatte PKC-ε en aktif ve inaktif mutantlar ifade. Devlet 3 solunum için digitonin-permeabilize hücrelerinde mitokondri + 5 mM malat (substrat kompleks I aracılığıyla okside), 10 mM süksinat + 0.1 uM rotenon (substrat kompleksine II aracılığıyla okside), veya 1 mM askorbat + 1 5 mM glutamat kullanılarak enerji verilmiştir mM N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD) (alt tabakalar kompleks ile okside IV). Sonuçlar ortalama ± SE. * - P <0.05.
Şekil 3. Kompleks I ve RPTC adenoviral vektör doğum sonrası 48 saatte PKC-ε, aktif ve inaktif mutantlar ifade izole mitokondride kompleks IV. Etkinlikler Sonuçlar ortalama ± SE. * - P <0.05.
Şekil 4. Zamana bağımlı PKC-ε ve yapısal olarak aktif (caPKC-ε) ve inaktif mutantlar (dnPKC-ε) taşıyan adenovirüs vektörü ile RPTC aşağıdaki enfeksiyon mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) değişiklikler. Sonuçlar, JC-1 monomerik biçimleri için toplam sayısına oranı olarak ifade edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± SE. * - P <0.05.
Şekil 5,. F 0 aktivitesi F izole mitokondri (A) ve ATP içerik 1-ATPase (B)RPTC adenoviral vektör doğum sonrası 48 saatte PKC-ε, aktif ve inaktif mutantlar ifade. Sonuçlar ortalama ± SE. * - P <0.05.
Şekil 6. Adenoviral vektör doğum sonrası 48 saatte PKC-ε, aktif ve inaktif mutantlar ifade canlı RPTC Mitokondriyal morfolojisi. A. Non-enfekte kontrolleri. B. RPTC caPKC-ε ifade. C. RPTC dnPKC-ε ifade. Canlı hücreler Temsilcisi görüntüleri bir floresan mikroskop altında incelenir. Orijinal büyütme, X630.
R Şekil 7. Zamana bağlı değişikliklerPTC oncosis (A) ve apoptoz PKC-ε ve yapısal olarak aktif (caPKC-ε) veya inaktif mutantlar (dnPKC-ε) taşıyan adenovirüs vektörü ile (B) Aşağıdaki enfeksiyonu. Boş pShuttle vektörü (İB = 50) kodlayan adenoviral parçacıkları ile Enfeksiyon 5.2 sonuçlandı ± 2.3% oncosis ve 5.5 ± enfeksiyondan sonra 48 saatte% 1,0 apoptoz. Sonuçlar ortalama ± SE. * - P <0.05. Adenoviral vektör doğum sonrası 48 saatte annexin V ve propidium iyodür floresans RPTC eksprese içinde caPKC-ε ve dnPKC-ε gösteren C. Örnek nokta araziler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yaklaşım renal proksimal tübül hücrelerinin birincil kültür içinde PKC izozimleri bireysel ekspresyonu için olanak sağlar. Bu yaklaşımın birçok güçlü yanları vardır: 1. Bu çeşitli hakaretler (iskemi, hipoksi, oksidatif stres), ilaçlar ve böbrek içinde nephrotoxicants için birincil hedef hücreler (renal proksimal tübüler hücreler) homojen bir nüfus düzenleyici mekanizmaları araştırmak için izin verir. 2. Iyileştirilmiş koşullarda primer kültür yetiştirilen RPTC in vitro modelinde bu Mitokondriyal fonksiyon vivo renal proksimal tübül mitokondrial fonksiyonları benzerler. 1,2 3. In vitro model bu farklı Toksik için mitokondri Tepki vivo renal proksimal tübül yanıta benzer. 4. Bu yaklaşım, sinyal transdüksiyon mekanik alakalı proteinler de dahil olmak üzere spesifik proteinler kodlayan genlerin bir etkili transfeksiyon ve dağıtım sağlarmitokondrial fonksiyonları düzenler sms. Dolayısıyla, bu model kinazlar ve fosfatazlar ve yapısal olarak aktif ve inaktif izozimlerinin seçici olarak ifade edilmesine olanak sağlar ve seçici olarak değildir ve genellikle toksik yan etkileri olan farmakolojik inhibitörleri ve aktivatörler için yerini alır. Bu modelin sınırlamalar şunlardır: 1. in vitro ortamda kültürlerinde RPTC kullanarak endokrin ve in vivo renal proksimal tübüllerde mitokondriyal fonksiyon düzenlenmesi ve 2 katkıda parakrin sinyal çalışmak için izin vermez. Bu model kronik koşulları incelemek için izin vermez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet Enstitüsü, Sindirim ve Böbrek Hastalıkları, 2R01DK59558 (GN) bir hibe ile desteklenmiştir. Araştırma Kaynakları hibe UL1 RR029884 Sağlık Ulusal Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen UAMS Dönüştürülebilir Araştırma Enstitüsü UAMS az Flow Sitometri Çekirdek kısmi finansmanını sağladı. Biz teşekkür Dr Peipei Ping (Los Angeles California Üniversitesi, Los Angeles, CA) cDNA PKC-ε ve Dr Allen Samarel (Loyola Üniversitesi Tıp Merkezi dominant negatif (inaktif) mutant kodlama taşıyan adenovirüs bir kısım sağlamak için; PKC-ε ve yapısal olarak aktif mutantı kodlayan adenoviral vektör bir alikotu sağlamak için Maywood, IL). Biz de Drs ederim. PKC-ε yapısal olarak aktif cDNA kodlama sağlamak için Peter Parker ve Peter Sugden (Imperial College London, Londra, İngiltere).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
