Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

ويرد وصف آثار تفعيل نظائر الانزيمات بروتين كيناز (بي كي سي) C على وظائف الميتوكوندريا المرتبطة التنفس والفسفرة المؤكسدة وعلى بقاء الخلية. النهج يتكيف تقنية الغدانية إلى overexpress انتقائي نظائر الانزيمات PKC في الثقافة الخلية الأولية ومجموعة متنوعة من فحوصات لتحديد وظائف الميتوكوندريا والطاقة حالة من الخلية.

Abstract

ويشارك البروتين كيناز C (بي كي سي) عائلة من نظائر الانزيمات في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. البيانات المتوفرة لدينا تثبت أن الأخيرة PKC ينظم وظيفة الميتوكوندريا الخلوية وحالة الطاقة. تقارير عديدة أثبتت أن تفعيل ε-PKC PKC واحد ويحسن وظيفة الميتوكوندريا في القلب الإقفاري ويتوسط كارديوبروتيكتيون. في المقابل، أظهرت لنا أن تشارك PKC-α وPKC ε في nephrotoxicant التي يسببها ضعف الميتوكوندريا وموت الخلايا في خلايا الكلى. ولذلك، كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج في المختبر من خلايا الكلى الحفاظ على الوظائف في الميتوكوندريا بالموقع نظائر الانزيمات التي يمكن تفعيلها بشكل انتقائي أو PKC تحول دون لتحديد دورها في تنظيم الفسفرة المؤكسدة وبقاء الخلية. تم زراعة الخلايا الأولية الثقافات الكلوي أنبوبي القريبة (RPTC) في ظروف أفضل مما أسفر عن التنفس ونشاط الميتوكوندريا ميتوchondrial الانزيمات مماثلة لتلك التي في RPTC في الجسم الحي. لأن التقنيات التقليدية ترنسفكأيشن (Lipofectamine، الصعق الكهربائي) غير فعالة في الثقافات الأولية ولها آثار ضارة على وظيفة الميتوكوندريا، تم تسليم PKC-ε cDNAs متحولة إلى RPTC من خلال ناقلات الغدانية. هذا النهج القائم على النتائج في ترنسفكأيشن أكثر من 90٪ RPTC مثقف.

هنا، نقدم طرق لتقييم دور PKC-ε في: 1. تنظيم التشكل الميتوكوندريا وظائف المرتبطة توليف ATP، و 2. بقاء RPTC في الثقافة الأولية. يتم تنشيط PKC-ε بواسطة overexpressing النشط جوهري PKC-ε متحولة. هو تحول دون PKC-ε بواسطة overexpressing متحولة غير نشط من PKC-ε. ويتم تقييم وظيفة الميتوكوندريا عن طريق فحص التنفس، سلامة السلسلة التنفسية، وأنشطة الجهاز التنفسي والمجمعات F 0 F 1-أتباز، ATP معدل الإنتاج، والمحتوى ATP. التنفس هوssessed في ديجيتونين-permeabilized RPTC كدولة 3 (التنفس القصوى في وجود ركائز الزائدة وADP) وفكت التنفس. يتم تقييم سلامة السلسلة التنفسية عن طريق قياس أنشطة جميع مجمعات أربعة من السلسلة التنفسية في الميتوكوندريا المعزولة. يتم تقييم قدرة الفسفرة المؤكسدة عن طريق قياس القدرة غشاء الميتوكوندريا، ATP معدل الإنتاج، ونشاط F 0 F 1-أتباز. ويتم تقييم الحالة من الطاقة RPTC من خلال تحديد المحتوى ATP داخل الخلايا. وتصور مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الأحمر MitoTracker 580، صبغة الفلورسنت التي تتراكم على وجه التحديد في الميتوكوندريا، وmonolayers حية يتم فحصها تحت المجهر الفلورسنت. ويتم تقييم جدوى استخدام RPTC annexin V / propidium تلطيخ يوديد تليها التدفق الخلوي لتحديد الخلايا وورام.

تسمح هذه الطرق لتفعيل انتقائي / تثبيط نظائر الانزيمات PKC الفرديةلتقييم دورها في الوظائف الخلوية في مجموعة متنوعة من الظروف الفسيولوجية والمرضية التي يمكن أن تكون مستنسخة في في المختبر.

Protocol

1. عزل الأنابيب الصغيرة الكلوي الدانية للثقافة الأولية

  1. تخدير الأرنب والمكوس الكليتين ووضعها في طبق بتري مليئة العازلة الإعدادية العقيمة (DMEM/F12 متوسطة) في الصفحي هود التدفق.
  2. الفوسفات مخزنة يروي كل الكلى مع 50 مل من العازلة تليها الإعدادية 50 مل من محلول ملحي معقم، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS)، والحديد PBS حل أكسيد (45 مل + 5 مل). دي الكبسولات الكلى ونقلها إلى المخزن المؤقت الإعدادية التي تحتوي على ديفيروكسامين.
  3. حصاد القشرة من كل الكلى.
  4. تجانس الأنسجة باستخدام 15 مل Dounce الخالط. صب أكثر من 2 جناسة المناخل شبكة العقيمة (85 ميكرون على الجزء السفلي و 235 ميكرومتر في الأعلى) وضعها فوق كوب L 1 معقمة. شطف مع المناخل ديفيروكسامين المحتوية العازلة.
  5. جمع أي نوع من الأنسجة المتبقية على منخل ميكرون 85 في أنبوب الطرد المركزي المخروطية العقيمة مليئة 35-40 مل من المخزن المؤقت التي تحتوي على ديفيروكسامين. مزيج بلطف التعليق الخلية.
  6. وضع قوي مagnet خارج الأنبوب لإزالة الحديد ملء الكبيبات، والسماح للتسوية التعليق. نضح الحديد من المغناطيس باستخدام ماصة باستور. كرر هذه العملية.
  7. إعداد 1 مل من المتوسط ​​الهضم التي تحتوي على وحدات 2،400-2،500 من كولاجيناز I و 0.6 ملغ مثبط التربسين فول الصويا حل في المخزن المؤقت ديفيروكسامين التي تحتوي على. فلتر تعقيم المتوسطة الهضم.
  8. ضبط مستوى الصوت لتعليق الخلية إلى 40 مل، وإضافة 1 مل من المتوسط ​​الهضم. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 17 دقيقة خلط بلطف التعليق، أجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، نضح المتوسط، وإضافة جديدة عازلة ديفيروكسامين.
  9. تكرار الإجراء إزالة الحديد مع المغناطيس عدة مرات، وتدور تعليق أسفل مرة أخرى، نضح المتوسطة، وإضافة 46 مل من المتوسط ​​لا تحتوي على السكر.
  10. المزيج بلطف وقياس من 500 ميكرولتر من التعليق إلى قسمين أنابيب إيبندورف سبق وزنه. تدور أسفل الخلايا في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة، نضح وسائل الإعلام، والموازنة بين بيليه. حساب العائد الكلي للكتلة الرطبة والبروتين.
  11. لوحة الخلايا في أطباق العقيمة 35 ملم على ثقافة كثافة البروتين 1 ملغ / طبق باستخدام الجلوكوز خالية DMEM/F12 المتوسط. خلايا الثقافة في 2 مل المتوسطة DMEM/F12 الجلوكوز خالية دائما على شاكر المداري في الحاضنة عند 37 ° C (95٪ الهواء / 5٪ CO 2). 1،2

2. الكلوي خلية أنبوب صغير الدانية الثقافة

  1. ثقافة المتوسط ​​هو خليط من DMEM 50:50 وهام في F-12 مزيج العناصر الغذائية دون الحمراء الفينول، البيروفات، والجلوكوز، على أن تستكمل مع 15 ملم NaHCO HEPES 15 مم، و 6 ملي اللاكتات (درجة الحموضة 7.4، 295 mosmol / KGH 2 O). وتستكمل وسائل الإعلام مع L-حمض الاسكوربيك فوسفات-2 (50 ميكرومتر)، الأنسولين البقري (10 نانومتر)، ترانسفيرين الإنسان (5 ملغ / مل)، الهيدروكورتيزون (50 نانومتر)، والسيلينيوم (5 نانوغرام / مل) مباشرة قبل وسائل الإعلام يوميا التغيير.
  2. نضح وسائل الإعلام القديمة من الأطباق باستخدام تقنية معقمة. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام، دافئة جديدة لكل طبق باستخدام تقنية معقمة. إعادةنال الخلايا القريبة أنبوبي (RPTC) تصل إلى نقطة التقاء في ما يقرب من 5-6 أيام بعد الطلاء. 1،2

3. الغدانية العدوى من RPTC

  1. عدوى الفيروسة الغدانية يتم في الثقافات، متموجة هادئة من RPTC بعد التغيير سائل الإعلام يوميا. السلبية السائدة PKC-ε متحولة (dnPKC-ε) والتي شيدت من قبل استبدال: 1) ليسين أرجينين في موقف مع 436 من موقع ATP ملزم و2) ألانين مع الغلوتامات في موقف 159 من المجال pseudosubstrate. دمرت هذه الطفرات نشاط بناء على كيناز دون تغيير التشكل نشطة من PKC-ε. وأدلى 3 PKC-ε بالموقع جوهري من حذف مخلفات 154-163 من المجال الخاص به pseudosubstrate المثبطة .. 4
  2. إضافة محلول المخزون من اتش تحمل caPKC-ε [كدنا] [كدنا] أو dnPKC-ε إلى كل طبق للحصول على تعدد المطلوب للعدوى (وزارة الداخلية) مما أدى إلى زيادة كبيرة في PKC-& epsilعلى؛ مستويات البروتين. احتضان RPTC مع اتش لمدة 24 ساعة. تغيير وسائل الإعلام والثقافة لخلايا أخرى على مدار 24 ساعة. ويمكن الحصول على مستويات زيادة كبيرة في البروتينات PKC-ε فسفرته ومجموع باستخدام ناقلات من 25-50 وزارة الداخلية الغدانية الترميز caPKC-ε. أكبر الزيادات في وزارة الداخلية نتائج أكبر في مستويات ε PKC-نشطة، ولكن لا ينصح في RPTC بسبب موت الخلايا السريع والخسارة. ويمكن الحصول على مستويات زيادة كبيرة من البروتين بي كي سي، ε نشط باستخدام 50-100 زارة الداخلية في RPTC دون إحداث آثار سلبية .. 5
  3. في 48 ساعة بعد الإصابة، ووسائل الإعلام الرشفة، وغسل monolayers مع PBS، وجمع الخلايا لتحليلها لتحديد طخة مناعية مستويات البروتين من ε-PKC .. 5

4. قياس التنفس RPTC

  1. إعداد مقايسة وجود مخزن مؤقت لقياس التنفس الدولة 3 (120 ملي بوكل، 5 ملي KH 2 PO HEPES 10 مم، 1 ملم MgSO و 2 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 7.4). لقياس معقدة I-جانب الدولة 3 التنفس، تكملة المخزن المؤقت مقايسة مع الغلوتامات 5 مم و 5 مم و 0.1 مالات ديجيتونين ملغ / مل. II-لمجمع يقترن التنفس الدولة 3، تكملة المخزن المؤقت مقايسة مع سكسينات 10 مللى، 0.1 ميكرومتر روتينون، و 0.1 ديجيتونين ملغ / مل. لمجمع IV-يقترن التنفس الدولة 3، تكملة المخزن المؤقت مقايسة مع أسكوربات مم 1، 1 ملم N، N، N '، N'-رباعي ميثيل-P-فينيلين (TMPD)، و 0.1 ديجيتونين ملغ / مل. وضع الحلول في حمام ماء C ° 37.
  2. نضح وسائل الإعلام من الثقافة التي تحتوي على طبق RPTC أحادي الطبقة، إضافة 2 مل من العازلة الدولة الدافئة التنفس 3، كشط بلطف خلايا من الطبق باستخدام شرطي المطاط، ونقل الأكسجين إلى التعليق غرفة مجهزة الاستهلاك الكهربائي من نوع كلارك.
  3. قياس التنفس حالة 2 (في حالة عدم وجود ADP). بدء الدولة 3 التنفس عن طريق إضافة ADP إلى تركيز النهائي من 0.4 مم. بدء الدولة 4 التنفس عن طريق إضافة أوليغوميسين إلى concentr النهائيأوجه من 0.5 ميكروغرام / مل. يتم قياس التنفس فكت من إضافة 0.5 ميكرومتر FCCP إلى الخلايا تتنفس في وزارة الخارجية 3. 6،7
  4. جمع التعليق الخلية من الدائرة، باستخدام حمض البروتين يعجل البيركلوريك، وتدور أسفل راسب. تحديد تركيز البروتين في الخلايا بيليه.

5. تحليل المحتملة غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm)

  1. إعداد 0.5 مم JC-1 الحل في ثقافة المتوسط ​​العقيمة.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من ببطء حل JC-1 لكل طبق للحصول على تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. دوامة طبق لخلط الصبغة بدقة. العودة إلى الأطباق الحاضنة لمدة 30 دقيقة.
  3. وضع الأطباق على الجليد، ووسائل الإعلام الرشفة، ويغسل مرتين مع monolayers الجليد الباردة PBS. الرشفة PBS، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد، تتخلص الخلايا من صحن ونقلها إلى أنبوب إيبندورف. تفريق monolayers في الخلايا واحد من pipetting لهم صعودا وهبوطا.
  4. تدور أسفل التعليق في 1،000 x ج لمدة 2 دقيقة، ASPغاضب طاف، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لبيليه وإعادة تعليقه للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
  5. تدور الخلايا إلى أسفل في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة، نضح طاف، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني، وإعادة تعليق بيليه. تحليل التدفق الخلوي مضان من قبل باستخدام الإثارة بواسطة الليزر الأرجون أيون 488 نانومتر. قراءة في الانبعاثات قناتين منفصلتين، عند 525 نانومتر FL1 وFL2 إلى 590 نانومتر. وأعرب عن غشاء الميتوكوندريا المحتملة ونسبة مضان FL2/FL1 .. 6

6. عزل الميتوكوندريا

  1. إعداد مخازن العزلة: المخزن المؤقت A (HEPES 10 مم، 225 مم مانيتول، 75 ملم السكروز، 0.1 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 7.4)، العازلة B (A العازلة التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، 1 ملم نا 3 VO 1 ملم ناف)، والاحتياطي C (10 مللى HEPES، 395 ملي السكروز، 0.1 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 7.4). تنفيذ كافة الخطوات على الجليد.
  2. غسل monolayers RPTC مرتين مع PBS العازلة الجليد الباردة. كشط في أنابيب إيبندورف monolayers وتدور لهمفي 500 x ج لمدة 5 دقائق. غسل بيليه في 1 مل من الاحتياطي A.
  3. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من B الاحتياطي، ونقل التعليق إلى الخالط 2 Dounce مل.
  4. التجانس الخلايا في الخالط Dounce حتى يتم كسر معظم الخلايا في جناسة عندما تفقد تحت المجهر.
  5. أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق في C. ° 4 جمع طاف وتدور عليه على 15،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه الخام التي تحتوي على الميتوكوندريا في 1 مل من الاحتياطي C. تدور supernatants أسفل على 15،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تكرار غسل مرتين أكثر بيليه .. 5
  7. لقياس أنشطة المجمعات الجهاز التنفسي، واعادة تعليق الميتوكوندريا بيليه في 50-100 ميكرولتر من العازلة فحص وتجميد في النيتروجين السائل. ذوبان الجليد عينات ببطء على الجليد.

7. قياس نشاط من NADH-يوبيكوينون مؤكسدة مختزلة (مجمع I)

  1. إعداد مقايسة المخزن المؤقت: 10 مم KH 2 PO 5 ملم MgCl ودرجة الحموضة 7.2. إضافة الدهنية حمض خالية BSA NADH والحصول على تركيزات النهائي من 0.25٪ و0.25 ملم، على التوالي. إضافة 2 ميكرولتر من محلول A (1 ملغ / مل) antimycin إلى تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل.
  2. تشغيل العينات في لوحة 48-جيدا شفافة. وتشمل عينة الفارغة التي لديها كل الإضافات لكن لا الميتوكوندريا. إلى كل بئر، إضافة 500 ميكرولتر من العازلة مقايسة مع اضافات والميتوكوندريا، واحتضان لوحة في C ° 30 مع خلط لمدة 5 دقائق.
  3. بدء رد فعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من يوبيكوينون ملي 3.25 إلى كل بئر. تسجيل الامتصاصية (340 نانومتر) لمدة 3 دقائق في فترات 20 ثانية. إضافة 5 ميكرولتر من حل روتينون (1 ملغ / مل) إلى كل بئر وتسجيل الامتصاصية للدقيقة 2 إضافية. حساب معقدة I النشاط كما روتينون حساسة الأكسدة NADH .. 7

8. قياس نشاط من سكسينات-يوبيكوينون مؤكسدة مختزلة (مجمع II)

إعداد مقايسة المخزن المؤقت التي تحتوي على حمض الدهنية خالية 0.25٪ BSA، و 20 ملي سكسينات البوتاسيوم، 0.25 ملم 2،6-dichloroindophenol، 2 ميكروغرام / مل antimycin A، و 10 ميكروغرام / مل روتينون.
  • تشغيل العينات في التكرارات في لوحة شفافة بشكل جيد 48-بما في ذلك عينة الفارغة التي لديها كل الإضافات لكن لا الميتوكوندريا. إلى كل بئر، إضافة 500 ميكرولتر من العازلة مقايسة مع اضافات والميتوكوندريا، واحتضان لوحة في C ° 30 مع خلط لمدة 2 دقيقة.
  • بدء رد فعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من يوبيكوينون ملي 3.25 إلى كل بئر. تسجيل الامتصاصية (595 نانومتر) لمدة 3 دقائق في فترات 20 ثانية. حساب مجمع II النشاط باتباع الحد من dichloroindophenol-2،6 .. 7
  • 9. قياس نشاط من مؤكسدة مختزلة السيتوكروم ج يوبيكوينول-(مجمع III)

    1. إعداد مقايسة المخزن المؤقت تحتوي على 0.1٪ الدهنية حمض خالية BSA، و 80 سكسينات البوتاسيوم مم، 10 روتينون ميكروغرام / لتر، و 0.24 ملي البوتاسيوم السيانيد.
    2. تشغيل عيناتفي التكرارات في لوحة شفافة بشكل جيد 48-بما في ذلك عينة الفارغة التي لديها كل الإضافات لكن لا الميتوكوندريا. إلى كل بئر، إضافة ميكرولتر 291 من المخزن المؤقت مقايسة مع اضافات والميتوكوندريا، واحتضان لوحة في C ° 30 مع خلط لمدة 5 دقائق.
    3. بدء رد فعل من إضافة 3 ميكرولتر من 6 مم أكسدة السيتوكروم ج إلى كل بئر. تسجيل الامتصاصية (550 نانومتر) لمدة 3 دقائق في فترات 20 ثانية. إضافة 5 ميكرولتر من حل A (1 ملغ / مل) antimycin إلى كل بئر وتسجيل الامتصاصية للدقيقة 2 إضافية. حساب مجمع III النشاط كما A-الحساسة antimycin الحد ج السيتوكروم .. 7

    10. قياس نشاط إنزيم السيتوكروم من (IV مجمع)

    1. ج السيتوكروم إعداد خفض بإضافة أسكوربات الصوديوم إلى حل ملي ج 9 من السيتوكروم وdialyzing الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 1 L من الفوسفات العازلة (10 ملي KH 2 PO درجة الحموضة 7.2) تحتوي على 5 ملم MgCl 2. إعداد مقايسة تحتوي على المخزن المؤقت0.1٪ الدهنية حمض خالية BSA وA antimycin (2 ميكروغرام / مل).
    2. تشغيل العينات في لوحة شفافة بشكل جيد 48-بما في ذلك عينة الفارغة التي لديها كل الإضافات لكن لا الميتوكوندريا. إلى كل بئر، إضافة 233 ميكرولتر من العازلة مقايسة مع اضافات والميتوكوندريا، واحتضان لوحة في C ° 30 مع خلط لمدة 5 دقائق.
    3. بدء رد فعل من ج السيتوكروم إضافة المخفضة (90 ميكرومتر تركيز النهائي). تسجيل الامتصاصية (550 نانومتر) لمدة 3 دقائق في فترات 20 ثانية. إضافة 2 ميكرولتر من حل KCN (8 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر وتسجيل الامتصاصية لمدة 2 دقيقة. حساب مجمع IV النشاط كما أكسدة KCN حساسة ج السيتوكروم .. 7

    11. قياس نشاط F 0 F 1-أتباز (ATP سينسيز)

    1. إعداد F 0 F 1-أتباز مقايسة العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ملي بوكل، 2 ملم MgCl ودرجة الحموضة 8.2). اعادة تعليق الميتوكوندريا بيليه في المخزن المؤقت الفحص، وتجميد عينات الميتوكوندريا في LIQUIد النيتروجين وذوبان الجليد العينات ببطء على الجليد.
    2. تشغيل العينات في ثلاث مكرارت في لوحة 48-جيدا شفافة. لكل مجموعة العلاج، سيتم تشغيل 2 الآبار لقياس حجم النشاط أتباز (275 ميكرولتر من العازلة الفحص، 5 ميكرولتر التعليق الميتوكوندريا، و 5 ميكرولتر من الايثانول 95٪) و 1 جيد لقياس أوليغوميسين الأحرف أتباز النشاط (275 ميكرولتر من المخزن المؤقت الفحص، 5 ميكرولتر التعليق الميتوكوندريا، و 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل أوليغوميسين في الايثانول 95٪).
    3. احتضان العينات عند C ° 31 لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز دائم. إضافة 16 ميكرولتر من 100 ملم حل ATP (درجة الحموضة 7.0) واحتضان في C ° 31 لمدة 5 دقائق مع اهتزاز دائم.
    4. بتحويل 200 ميكرولتر من خليط الحضانة إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من TCA M 3. احتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقيقة وتدور عليهم في 10،000 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. استخدام supernatants والكريات لتحديد نسبة البروتين والفوسفات، على التوالي.
    5. تحديد محتوى الفوسفات في supernatants باستخدامغير العضوية الفوسفات الفحص. إعداد 100 مل من الكاشف سومنر بإضافة 0،88 ز FeSO 4 حتي 10 مل من 3.75 MH 2 SO 4 والتكيف مع 90 مل مع H 2 O. إضافة 10 مل من محلول الأمونيوم موليبدات (0.66 مل g/10 H 2 O) في حل FeSO 4 في H 2 SO 4. بعيدا عن الضوء.
    6. تحميل 96-وحة جيدا مع 50 ميكرولتر من الفوسفات لكل معيار (0 - 1،000 ميكرومتر KH 2 PO 4) و 50 ميكرولتر من كل طاف في التكرارات. إضافة 250 ميكرولتر من الكاشف سمنر إلى كل بئر واحتضان لوحة في C ° 30 لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز دائم.
    7. تسجيل الامتصاصية في 595 نانومتر في درجة حرارة الغرفة. F 0 F يتم تحديد 1-أتباز النشاط عن طريق قياس أوليغوميسين حساسة الإفراج عن ط P من ATP ونحن سبق وصفها. 7،8 احسب مجموع الأحرف وأوليغوميسين F 0 F 1-أتباز الأنشطة. لحساب أوليغوميسين حساسة أتباز موارد الوراثية الحيوانيةvity، طرح أوليغوميسين الأحرف النشاط من إجمالي النشاط أتباز. 8،9

    12. قياس محتوى ATP داخل الخلايا

    1. الأطباق التي تحتوي على ثقافة المكان monolayers RPTC على الجليد والمتوسطة الرشفة، وغسل monolayers مرتين مع PBS العازلة الجليد الباردة. إضافة 1 مل PBS لكل أحادي الطبقة، كشط كل أحادي الطبقة إلى PBS، وجمع تعليق الخلية في أنبوب إيبندورف. تدور أنابيب إيبندورف في microfuge لمدة 5 ثوانى.
    2. تحديد محتوى ATP في كل عينة RPTC بواسطة الأسلوب وسيفيراز باستخدام الفحص ضوء بارد ATP كيت HS II (روش) وبروتوكول الشركة المصنعة. تحديد تركيز البروتين في كل عينة وحساب تركيز ATP في البروتين ملغ .. 8

    13. تصور الصرف الميتوكوندريا

    1. تغيير وسائل الإعلام الثقافة. إضافة 2 ميكرولتر من حل ميكرومتر 100 من 580 إلى الأحمر MitoTracker كل طبق (اضرب النهائي. 100 نانومتر) ويعود إلى الأطباق incubatoR لمدة 30 دقيقة.
    2. دراسة monolayers الحية تحت المجهر الفلورسنت الهدف باستخدام الغمر بالماء .. 5

    14. تحليل بقاء الخلية

    1. في 24 ساعة قبل بدء الفحص تجهيز 50 ملم من حل سيسبلاتين لعلاج الخلايا التي ستكون بمثابة مراقبة إيجابية لموت الخلايا المبرمج (V-annexin إيجابية الخلايا). أيضا، وإعداد 500 ملم من حل butylhydroperoxide-ثلاثي لعلاج الخلايا التي ستكون بمثابة الضوابط الإيجابية لورام (يوديد propidium إيجابية الخلايا).
    2. علاج أطباق 2 مع 2 ميكرولتر من سيسبلاتين 50 مم و 2 مع 2 ميكرولتر الأطباق 500 مم ثلاثي butylhydroperoxide. 1 طبق تكريس لعنصر تحكم عدم وصمة عار.
    3. في 24 ساعة بعد العلاج مع سيسبلاتين وTBHP، وإعداد ملزمة المخزن المؤقت (ملي Hepes 10، 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 1.8 ملي CaCl 2) ويوديد propidium الحل (PI) (50 ميكروغرام / مل) في المخزن المؤقت ملزمة.
    4. يغسل مرة واحدة مع monolayers برتقالي ملزمةإيه. إضافة 1 مل من الجليد الباردة عازلة و 50 ميكرولتر من محلول PI إلى كل طبق باستثناء الخلايا V-الإيجابية عدم وصمة عار وannexin. تغطية أطباق واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز المدارية لطيف.
    5. غسل monolayers مع المخزن المؤقت ملزمة (10 دقيقة) وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت ملزمة و 2 ميكرولتر من حل V-FITC Annexin إلى كل طبق باستثناء الخلايا عدم وصمة عار وPI إيجابية. تغطية أطباق واحتضان RT في لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز المدارية لطيف.
    6. نضح المخزن المؤقت وغسل monolayers مع 1 مل من الجليد الباردة العازلة ملزمة على الجليد لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز المدارية لطيف. كرر الخطوة الغسيل.
    7. نضح المخزن المؤقت ملزمة وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة ملزمة لكل طبق. كشط بلطف باستخدام خلايا شرطي المطاط ونقل الخلايا في التدفق الخلوي أنابيب. تفريق الخلايا في خلية واحدة من التعليق عينات pipetting صعودا وهبوطا. تفريق أي تجمعات الخلايا.
    8. تحديد PI وannexin مضان FITC V-فورا فلوث الخلوي باستخدام الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات إلى 590 و 530 نانومتر لPI وFITC، على التوالي. عد 10000 فعاليات لكل عينة.
    9. وضع مضان FITC على المحور X ومضان PI على المحور Y للأرقام التدفق الخلوي مؤامرة نقطة. وتعتبر الخلايا إيجابية للV Annexin والسلبية لPI أفكارك. وتعتبر الخلايا الإيجابية والسلبية لPI لV Annexin الجرمي. 10،11

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    الشكل 1 يبين أن تسليم الغدانية من [كدنا] ترميز بالموقع جوهري (caPKC-ε) وغير نشطة (dnPKC-ε) من المسوخ PKC-ε النتائج في مستويات البروتين زيادة كبيرة في ε-PKC في RPTC والميتوكوندريا. overexpressed الخلايا المصابة مع [كدنا] تحمل ناقلات caPKC-ε في فسفرته (نشط) شكل ε-PKC بينما الخلايا المصابة مع الترميز dnPKC-ε overexpressed [كدنا] PKC-ε التي كانت غير نشطة (لا فسفرته) (الشكل 1). وجود بالموقع PKC-ε انخفضت التنفس الميتوكوندريا في RPTC بغض النظر عن الركيزة المستخدمة لتنشيط الميتوكوندريا في حين أن غير نشط PKC-ε لم يكن لها تأثير (الشكل 2). قررنا من أجل تحديد أهداف PKC-ε بالموقع ضمن السلسلة التنفسية، أنشطة جميع مجمعات الأنزيمية من السلسلة التنفسية. كما هو موضح في الشكل (3) (الشكل 4). وقد رافق هذه التغيرات نقصان في نشاط F 0 F 1-أتباز (ATP سينسيز) في الميتوكوندريا المعزولة من overexpressing RPTC النشط PKC-ε (الشكل 5A). ونتيجة لذلك، فإن محتوى ATP من overexpressing RPTC النشط PKC-ε انخفض (الشكل 5B). كان التنشيط المستمر للε-PKC آثار عميقة على التشكل الميتوكوندريا الميتوكوندريا عن طريق حفز تجزئة (الانشطار) (الشكل 6B). PKC-ε التنشيط، ولكن ليس تثبيط، أسفرت أيضا عن التغييرات في مورفولوجية RPTC يسبب انكماش خلية استطالة الثانية من الخلايا على قيد الحياة. ضعف الميتوكوندريا والتعديلات في التشكل في الميتوكوندريا overexpressing RPTC ورافق بالموقع PKC-ε من موت الخلايا من قبل كل من ورام وموت الخلايا المبرمج (الشكل 7). في 48 ساعة بعد تسليم ناقلات الغدانية، ما يقرب من 50٪ من overexpressing RPTC النشط PKC-ε غير قابلة للتطبيق. كان overexpression من شكل غير نشط من PKC-ε أي تأثير على وظيفة الميتوكوندريا والتشكل، وعلى الجدوى RPTC.

    وبالتالي، والتسليم الغدانية من [كدنا] نظائر الانزيمات المختلفة ترميز PKC هو أداة فعالة تمكن overexpression الانتقائي للنظائر الانزيمات PKC الفردية والمسوخ النشطة أو الخاملة في الثقافات الرئيسي لخلايا الكلى. فإنه يسمح للكفاءة ترنسفكأيشن من الخلايا المزروعة في الثقافة الأولية لدراسة وتنظيم الوظائف الخلوية المختلفة وتقييم شكل الخلية وقدرتها على البقاء من قبل تحركات البروتينات.

    الأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 1
    الشكل 1. مستويات البروتين من فسفرته (نشط) PKC-ε (PKC-P-ε) ومجموع PKC-ε في الخليط الخلية (اللوحة اليسرى) والميتوكوندريا (اللوحة اليمنى) معزولة عن الثقافات الأولية للمصاب RPTC ناقلات تحمل الغدانية نشط جوهري (caPKC-ε) أو غير نشطة المسوخ (dnPKC-ε) من PKC-ε في نقاط زمنية مختلفة بعد الولادة ناقلات الغدانية. مستويات أكتين-β وF 0 F. 1-أتباز تستخدم عناصر تحكم التحميل هلام لخلية الخليط والميتوكوندريا على التوالي، الرقم معدلة من نواك وآخرون .. 5

    الشكل 2
    الشكل 2. الدولة(3) وفكت التنفس في RPTC معربا عن المسوخ نشطة وغير نشطة من PKC-ε في 48 ساعة بعد الولادة الغدانية. للتنفس الدولة 3، تم تنشيط الميتوكوندريا في الخلايا ديجيتونين-permeabilized باستخدام 5 ملم + 5 الغلوتامات ملي مالات (المؤكسد من خلال ركائز معقدة I)، 10 ملم + سكسينات روتينون ميكرومتر 0.1 (الركيزة المعقدة المؤكسد من خلال II)، أو 1 + 1 ملم أسكوربات ملي N، N، 'N، N'-رباعي ميثيل-P-فينيلين (TMPD) (المؤكسد من خلال ركائز معقدة IV). النتائج هي متوسط ​​± SE. * - P <0.05.

    الشكل 3
    الشكل 3. أنشطة معقدة الأول والرابع في مجمع الميتوكوندريا المعزولة من RPTC معربا عن المسوخ نشطة وغير نشطة من PKC-ε في 48 ساعة بعد الولادة ناقلات الغدانية. النتائج هي متوسط ​​SE ±. * - P <0.05.

    الشكل 4
    الشكل 4. التغييرات المعتمدة على الزمن في المحتملة غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) في العدوى التالية RPTC مع ناقلات الغدانية تحمل طفرات بالموقع جوهري (caPKC-ε) وغير نشطة (dnPKC-ε) من PKC-ε. يتم التعبير عن النتائج كنسبة من إجمالي موحودي لأشكال من JC-1. النتائج هي متوسط ​​± SE. * - P <0.05.

    الشكل 5
    الشكل 5. نشاط F 0 F 1-أتباز في الميتوكوندريا المعزولة محتوى ATP (A) و (B)في RPTC معربا عن المسوخ نشطة وغير نشطة من PKC-ε في 48 ساعة بعد الولادة ناقلات الغدانية. النتائج هي متوسط ​​± SE. * - P <0.05.

    الشكل 6
    الشكل 6. التشكل في الميتوكوندريا RPTC حية تعبر عن المسوخ نشطة وغير نشطة من PKC-ε في 48 ساعة بعد الولادة ناقلات الغدانية. A. غير المصابة الضوابط. B. RPTC معربا عن caPKC-ε. C. RPTC معربا عن dnPKC-ε. فحص الصور ممثل الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت. التكبير الأصلي، X630.

    الشكل 7
    الشكل 7. التغييرات المعتمدة على الزمن في RPTC ورام (A) وموت الخلايا المبرمج (B) بعد الإصابة مع ناقلات الغدانية تحمل طفرات بالموقع جوهري (caPKC-ε) أو الخاملة (dnPKC-ε) من PKC-ε. أدى العدوى مع جزيئات ترميز الغدانية متجه pShuttle فارغة (وزارة الداخلية = 50) في 5.2 ± 2.3٪ ورام و 5.5 ± 1.0٪ في موت الخلايا المبرمج 48 ساعة بعد الإصابة. النتائج هي متوسط ​​± SE. * - P <0.05. C. الممثل المؤامرات نقطة مما يدل annexin V وpropidium مضان يوديد في overexpressing RPTC caPKC-ε ε-dnPKC وبعد 48 ساعة بعد الولادة ناقلات الغدانية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    النهج المقدمة هنا يسمح للoverexpression من نظائر الانزيمات الفردية PKC في الثقافة الأساسية للخلايا الكلى أنبوبي القريبة. هناك العديد من نقاط القوة لهذا النهج: 1. لأنها تتيح للتحقيق في الآليات التنظيمية في عدد السكان متجانسة من الخلايا (خلايا الكلى الأنبوبي الداني) التي هي الهدف الرئيسي لمختلف الشتائم (نقص التروية، نقص الأكسجة، الاكسدة)، والمخدرات، وnephrotoxicants داخل الكلى. 2. وظائف الميتوكوندريا في هذا النموذج في المختبر من RPTC نمت في الثقافة الأولية في تحسين ظروف تشبه وظائف الميتوكوندريا من الأنابيب الكلوية الدانية في الجسم الحي. 1،2 3. رد الميتوكوندريا إلى المواد السامة المختلفة في هذا النموذج في المختبر مشابهة لاستجابة الأنابيب الكلوية الدانية في الجسم الحي. 4. هذا النهج يسمح لترنسفكأيشن كفاءة وتسليم الجينات الترميز بما في ذلك البروتينات المحددة البروتينات المشاركة في إشارة تنبيغ mechaniالرسائل القصيرة التي تنظم وظائف الميتوكوندريا. وهكذا، هذا النموذج يسمح للتعبير الانتقائي للنظائر الانزيمات النشطة وغير النشطة جوهري من كاينيسات وphosphatases ويحل محل الحاجة إلى مثبطات الدوائية وتفعيل ليست انتقائية كما وغالبا ما يكون من الآثار الجانبية السامة. القيود المفروضة على هذا النموذج ما يلي: 1. باستخدام RPTC مثقف في المختبر في بيئة لا تسمح لدراسة الغدد الصماء ونظير الصماوي إشارات التي تسهم في تنظيم وظيفة الميتوكوندريا في الأنابيب الكلوية الدانية في الجسم الحي، و 2. هذا النموذج لا يسمح لدراسة الحالات المرضية المزمنة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، 2R01DK59558 (لGN). قدم معهد بحوث UAMS بالحركة بدعم من المعاهد الوطنية للصحة المركز الوطني للبحوث منحة UL1 الموارد RR029884 التمويل الجزئي لقياس التدفق الخلوي في كور UAMS. نشكر الدكتور Peipei بينغ (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، لوس أنجلوس، CA) لتوفير قسامة من اتش يحمل الترميز [كدنا] متحولة السلبية (غير نشط) المهيمن PKC-ε، والدكتور ألين Samarel (جامعة لويولا الطبي؛ مايوود، IL) لتوفير قسامة من ناقلات الغدانية ترميز متحولة بالموقع جوهري من PKC-ε. كما نشكر الدكاترة. بيتر باركر وسودن بيتر (إمبريال كوليدج لندن، لندن، المملكة المتحدة) لتوفير الترميز [كدنا] نشطة جوهري PKC-ε.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
    2. Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
    3. Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
    4. Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
    5. Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
    6. Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
    7. Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
    8. Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
    9. Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
    10. Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
    11. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
    تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter