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Biology

评估肾细胞​​蛋白激酶C同工酶,线粒体功能及细胞活力的

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

活化的蛋白激酶C(PKC)的同工酶与呼吸,氧化磷酸化有关的线粒体功能和对细胞活力的影响进行说明。该方法适应腺病毒技术,选择性过度表达PKC同工酶在原代培养和各种检测,以确定线粒体功能和能量状态的细胞。

Abstract

同功酶的蛋白激酶C(PKC)家族参与了许多生理和病理过程。我们最近的数据表明,PKC调节线粒体的功能和细胞能量状态。许多报告表明激活PKC-αPKC-ε提高在缺血性心脏的线粒体功能和介导的心脏保护作用。相反,我们已经表明,PKC-α和PKC-ε参与在nephrotoxicant诱导的线粒体功能障碍和肾脏细胞中的细胞死亡。因此,本研究的目标是开发PKC同工酶可以选择性地激活或抑制,以确定其氧化磷酸化和细胞生存的调节作用,保持积极的线粒体功能的肾细胞的体外模型。培养更好的条件,导致线粒体线粒体呼吸和活动的原代培养肾小管上皮细胞(RPTC)线粒体酶类似于那些在RPTC 体内 。由于传统的转染技术(脂质体转染,电穿孔)在原代培养中是低效的,对线粒体功能产生不利影响,PKC-ε突变cDNA分别传递到RPTC通过腺病毒载体。这种做法的结果转染培养RPTC超过90%。

在这里,我们提出了评估的作用,PKC-ε的方法:1。调节线粒体形态和ATP合成,和2与相关联的功能。 RPTC在小学文化的生存期。由过度的组成性激活PKC-ε突变激活PKC-ε。 PKC-ε抑制过度的无效突变体的PKC-ε。线粒体功能的评估是通过检查呼吸,呼吸链的完整性,活动,呼吸复合物和F 0 F 1-ATP酶,ATP生成率和ATP含量。呼吸是ssessed的毛地黄皂苷-透性RPTC状态3(最大呼吸中存在的多余的基板和ADP)和非耦合呼吸。呼吸链的完整性进行评估,通过测量所有4个配合物中分离线粒体呼吸链的活动。氧化磷酸化的能力的评价通过测定线粒体膜电位,ATP生成率,和F 0 F 1-ATP酶的活性。的RPTC的能源状况进行评估,确定细胞内ATP含量。在活细胞中的线粒体形态可视化使用Mitotracker有红580,专门蓄积在线粒体内的荧光染料,和活的单层,在荧光显微镜下检查。 RPTC可行性评估采用膜联蛋白V /碘化丙啶染色后流式细胞仪测定细胞凋亡和胀亡。

这些方法允许在个别的PKC同功酶的选择性激活/禁止,以评估它们的作用,在细胞功能中的各种生理和病理条件,可以在体外再现。

Protocol

1。原代培养肾小管上皮分离

  1. 麻醉兔,切除双侧肾脏,并将其放置在培养皿中充满了消毒缓冲(DMEM/F12介质)在层流罩。
  2. 每个肾灌注用50ml准备缓冲后跟50毫升无菌磷酸盐缓冲盐水,pH 7.4(PBS)中,PBS-氧化铁溶液(45毫升+ 5毫升)。德封装的肾脏和转移他们的准备缓冲液去铁胺。
  3. 收获皮质每个肾。
  4. 使用15毫升的Dounce匀浆器匀化组织。超过2无菌网筛(85微米的底部和顶部235微米的)放置超过1升的无菌烧杯中倒入匀浆。冲洗筛去铁胺的缓冲。
  5. 收集85μm的筛上留下的任何组织,在无菌的离心管中填充用35-40毫升的去铁胺的含缓冲。轻轻混合细胞悬浮液。
  6. 建立一个强大米agnet管外部的除去铁填充肾小球,让悬浮液中定居。从磁铁使用巴斯德吸管的吸液铁。重复此过程。
  7. 准备1毫升消化培养基含有2,400-2,500单位的I型胶原酶和0.6毫克的大豆胰蛋白酶抑制剂溶解在去铁胺的含缓冲。过滤消毒的消化介质。
  8. 调整细胞悬浮液的体积至40ml,并加入1毫升的消化培养基。轻轻悬浮液混合17分钟,离心,在50×g离心2分钟,在4℃,在室温下孵育,吸出培养基,并添加新鲜的去铁胺缓冲液。
  9. 重复的铁除去与磁铁的过程几次,旋转的悬浮液再次向下,吸出培养基,并加入46毫升的不含有葡萄糖的培养基中。
  10. 轻轻混匀,并测量出500微升该悬浮液分为两个预先称重的Eppendorf管中。旋转细胞以10,000 xg 1分钟,抽吸介质,重量的颗粒。计算湿质量和蛋白质的总收率。
  11. 板的细胞在无菌的35毫米的培养皿中,在1毫克蛋白质/培养皿,使用无葡萄糖DMEM/F12培养基的密度。在2ml无葡萄糖的DMEM/F12培养基总是在轨道摇床中在37℃下(95%空气/ 5%CO 2)的培养箱。1,2的培养细胞

2。肾小管上皮细胞培养

  1. 培养基是DMEM和Ham氏F-12营养混合不加酚红,丙酮酸盐,和葡萄糖的50:50混合物,补充有15毫摩尔的NaHCO 3,15mM的HEPES,和6mM乳酸(pH值7.4,295 mosmol / KGH 2 O)。媒体补充与L-抗坏血酸-2 - 磷酸(50μM),牛胰岛素(10纳米),人转铁蛋白(5毫克/毫升),氢化可的松(50纳米),和硒(5纳克/毫升),在紧接每日媒体的变化。
  2. 吸旧媒体使用无菌技术菜肴。温暖,新鲜的培养基中加入2毫升每道菜都使用无菌技术。重新NAL近端肾小管上皮细胞(RPTC)达到汇合后约5-6天,在电镀1,2。

3。腺病毒感染的RPTC

  1. 腺病毒感染进行融合,静态的文化RPTC后的每日媒体的变化。显性负的PKC-ε突变(dnPKC-ε),通过更换构成:1)赖氨酸与精氨酸,在436位的ATP-结合位点,以及2)在位置与谷氨酸丙氨酸159的假底域。这些突变破坏结构的激酶活性不改变PKC-ε的活性构象。3 PKC-ε组成删除其抑制假底域的残基154-163。
  2. 添加存货溶液重组腺病毒caPKC-ε的cDNA或dnPKC-εcDNA的每个培养皿中,以获得期望的多重性感染(MOI)导致显着增加的蛋白激酶C-&epsil的“;蛋白水平。孵育24小时腺病毒RPTC。改变媒体和培养细胞中的另一个24小时。显著磷酸化和总的PKC-ε蛋白水平的提高,可以得到使用25-50 MOI的腺病毒载体编码caPKCε。大MOI的结果增加更大的积极PKC-ε的水平,但它不建议在RPTC由于快速的细胞死亡和损失。显著水平升高的非活动的PKC-ε蛋白可以使用50-100 MOI方式获得不产生不利影响的情况下在RPTC 5
  3. 在感染后的48小时内,抽吸介质,洗单分子膜与PBS,并收集细胞进行免疫印迹分析,以确定蛋白质水平的PKC-ε。

4。 RPTC呼吸的测量

  1. 准备一个测定缓冲液,用于测定状态3呼吸(120 mM KCl中,5mM的KH 2 PO 4,10mM的HEPES,1mM的用MgSO 4,和2mM EGTA,pH值7.4)。为了测量复杂的I耦合状态3呼吸,补充的测定缓冲液,5mM的谷氨酸,5mM的苹果酸盐和0.1毫克/毫升的毛地黄皂苷。对于复杂的II-耦合状态3呼吸,补充的测定缓冲液中的10mM琥珀酸盐,0.1μM鱼藤酮,和0.1毫克/毫升毛地黄皂苷。对于复杂的IV-耦合状态3呼吸,补充试验缓冲液,1mM的抗坏血酸盐,1mM的N,N,N',N'-四甲基 - 对 - 苯二胺(TMPD),和0.1毫克/毫升毛地黄皂苷。在37℃水浴中放置的解决方案。
  2. 吸媒体从培养皿中包含RPTC单层,加入2毫升的热态3呼吸缓冲,轻轻地刮细胞的菜用橡胶警察,将暂停Clark型电极消耗氧气室配备。
  3. 测量状态的呼吸(ADP的情况下)。启动状态3呼吸由ADP添加至终浓度为0.4mM。由增加的最终concentr寡启动状态4呼吸通报BULLETIN为0.5微克/毫升。非耦合测量呼吸,加入0.5μMFCCP,细胞呼吸作用状态3。6,7
  4. 从腔室中收集的细胞悬浮液,沉淀蛋白质,使用高氯酸,和自旋向下的沉淀。确定在蜂窝沉淀的蛋白质浓度。

5。分析线粒体膜电位(ΔΨm)的

  1. 准备0.5mM的JC-1溶液中的无菌培养介质中。
  2. 缓慢加入20微升的JC-1溶液每个培养皿中,得到最终浓度为5μM。涡流盘来彻底混合染料。返回的菜肴的培养箱30分钟。
  3. 放菜在冰上,吸出物的介质,并用冰冷的PBS洗单层两次。吸出PBS,加1毫升的新鲜PBS,刮细胞的菜,然后将其转移到离心管中。吹打起来,并成单细胞单分子膜。
  4. 旋转暂停2分钟,ASP在1000 XG发怒的上清液,加入1毫升的PBS中,以沉淀和重新悬浮,得到单细胞悬浮液。再次重复此步骤,如果必要的话。
  5. 旋转细胞在1000×g离心2分钟,吸取上清液,加0.5毫升的PBS,重悬颗粒。分析通过流式细胞仪检测488 nm氩离子激光激发荧光。在两个独立的通道,FL1为525 nm和590 nm的FL2在阅读排放。线粒体膜电位作为荧光比例FL2/FL1。6表示

6。线粒体分离

  1. 准备隔离缓冲液:缓冲液A(10mM的HEPES,225 mM的甘露糖醇,75 mM蔗糖,0.1mM的EGTA,pH值7.4),缓冲液B(缓冲液A含有蛋白酶抑制剂,1mM的的Na 3 VO 4,1mM的氟化钠),和缓冲器C(10mM的HEPES,395 mM蔗糖,0.1mM的EGTA,pH值7.4)。在冰上执行所有步骤。
  2. RPTC单层洗净两次,用冰冷的PBS缓冲液。刮Eppendorf管中旋转的单分子膜在500×g离心5分钟。在1ml的缓冲液A洗涤沉淀
  3. 重新悬浮沉淀在1ml的缓冲液B中,并且该悬浮液转移到一个2毫升的Dounce匀浆器。
  4. 均质的Dounce匀浆器中的细胞匀浆中,直到大部分的细胞在显微镜下检查时,被破坏。
  5. 以1,000 xg离心5分钟,在4℃下离心匀浆收集上清液并和旋转下降,以15,000 xg离心10分钟,在4℃下
  6. 丢弃上清液,并重新悬浮的颗粒含有粗线粒体在1ml的缓冲液C.附带上清液以15,000 xg离心10分钟,在4℃下重复5的粒料的2次以上的洗涤。
  7. 为了测量呼吸配合物的活动,重新悬浮线粒体沉淀在50-100微升测定缓冲液并冷冻在液氮中。慢慢地在冰上解冻样品。

7。测量活动的NADH-泛醌氧化还原酶(复合体I)

  1. 准备的测定缓冲液:10mM的KH 2 PO 4,5毫摩尔的MgCl 2,pH值7.2。加入无脂肪酸BSA和NADH,得到最终浓度为0.25%和0.25mM,分别。抗霉素A溶液(1毫克/毫升)中加入2μl至终浓度为2微克/毫升。
  2. 在48孔透明板运行的样品。包括空白样品,有所有增加,但没有线粒体。向每孔加入500微升测定缓冲液与加法和线粒体中,并混合5分钟,在30℃下孵育板。
  3. 启动反应,向每孔加入10微升3.25 mM的泛醌。记录的吸光度(340 nm)的为3分钟,在20秒的间隔。加入5μl的鱼藤酮溶液(1毫克/毫升)的每个孔中,并记录额外的2分钟的吸光度。计算复杂,我鱼藤酮敏感的NADH氧化活性。

8。测量活动琥珀酸泛醌氧化还原酶(复合物Ⅱ)

准备的测定缓冲液含有0.25%脂肪酸游离BSA,的20mM钾琥珀酸,0.25毫摩尔2,6 - 二氯靛酚,2微克/毫升抗霉素A,和10μg/ ml的鱼藤酮。
  • 在48孔透明板,包括空白样品,有所有增加,但没有线粒体,运行的样品一式两份。向每孔加入500微升测定缓冲液与加法和线粒体中,并混合2分钟,在30℃下孵育板。
  • 启动反应,向每孔加入10微升3.25 mM的泛醌。记录的吸光度(595 nm)的为3分钟,在20秒的间隔。计算复合物II活性的2,6 -二氯靛酚还原后。
  • 9。辅酶Q-细胞色素C还原酶活性的测量(情结III)

    1. 准备的测定缓冲液,含有0.1%无脂肪酸的牛血清白蛋白,80mM的琥珀酸钾,10μg/ ml的鱼藤酮,和0.24 mM的钾氰化物。
    2. 运行样品在48孔透明板,包括空白样品,有所有增加,但没有线粒体的副本。向每孔加入291微升测定缓冲液与加法和线粒体中,并混合5分钟,在30℃下孵育板。
    3. 开始反应6 mM的氧化中的细胞色素c在各孔中加入3微升。记录的吸光度(550 nm)的为3分钟,在20秒的间隔。抗霉素A溶液(1毫克/毫升),每孔加入5μl和记录额外的2分钟的吸光度。计算复杂III活性,抗霉素A敏感的细胞色素C还原。7

    10。细胞色素氧化酶的活性测定(复杂IV)

    1. 准备9的细胞色素c的1mM溶液中加入抗坏血酸钠和透析过夜,4℃下在1升的磷酸盐缓冲液中(10mM的KH 2 PO 4,pH 7.2)中含有5mM MgCl 2的溶液,降低了对细胞色素c。准备在测定缓冲液中,其中包含0.1%无脂肪酸的牛血清白蛋白和抗霉素A(2微克/毫升)。
    2. 在48孔透明板,包括空白样品,有所有增加,但没有线粒体,运行样本。向每孔加入233微升测定缓冲液与加法和线粒体中,并混合5分钟,在30℃下孵育板。
    3. 除了减少,细胞色素c(90μM的最终浓度),开始反应。记录的吸光度(550 nm)的为3分钟,在20秒的间隔。 2微升的KCN溶液(8微克/毫升)加入到每个孔中并记录另外2分钟的吸光度。计算KCN敏感的细胞色素c氧化复合物IV的活性。

    11。活性测定的F 0 F 1-ATP酶(ATP酶)

    1. 准备F 0 F 1-ATP酶检测缓冲液(10mM的Tris-HCl,200 mM KCl中,2毫摩尔MgCl 2,pH 8.2)中。检测缓冲液中重悬线粒体颗粒,冻结线粒体样品的液体。三维氮气,慢慢地在冰上解冻样品。
    2. 运行一式三份样品在48孔透明板。每个治疗组中,2的井将运行来测量总的ATP酶活性(275微升测定缓冲液,5微升线粒体悬浮液,和5微升95%乙醇中)和1,以及测量寡霉素不敏感的ATP酶活性(275微升测定缓冲液,5微升的线粒体悬浮液,和5微升的1毫克/毫升的寡霉素在95%乙醇溶液)。
    3. 在31°C孵育10分钟恒定的颤抖。加入16微升的100 mM ATP溶液(pH 7.0),在31℃孵育5分钟,使用恒定的震动。
    4. 200μl的培养混合物转移到一个管中,50μl的3 M TCA。孵育样品在冰上10分钟,和自旋下来以10,000 xg离心5分钟,在4℃。使用上清颗粒,以确定磷酸盐和蛋白质含量分别。
    5. 确定使用上清液中的磷酸盐含量无机磷酸盐的测定。准备加入0.88克硫酸亚铁4至10毫升3.75 MH 2 SO 4和调整到第90毫升,用H 2 O,100毫升的萨姆纳试剂按到该溶液中的FeSO 4在H 2 SO 4,加入10毫升的钼酸铵溶液(0.66克毫升H 2 O)。避光。
    6. 负载96孔板中,用50μl每个磷酸标准(0 - 1,000μM的KH 2 PO 4)和50μl的每种上清液重复。每孔加入250μl的萨姆纳试剂的板在30°C孵育15分钟恒定的颤抖。
    7. 记下在室温下在595 nm处的吸光度。 F 0 F 1-ATP酶活性,是由从ATP测量的寡霉素敏感的释放 P i,正如我们前面所述。7,8计算总和寡霉素不敏感的F 0 F 1-ATP酶活性。计算寡敏感的ATP酶激活VITY,寡不敏感减去总ATP酶活性的活动。8,9

    12。细胞内ATP含量的测定

    1. 将培养皿RPTC膜的冰,吸出培养基,用冰冷的PBS缓冲液洗两次单层。加入1 ml PBS中,各单层,刮去各单层的PBS中,并在Eppendorf管中收集的细胞悬浮液。附带的Eppendorf管中,在5秒的离心。
    2. 确定在每个RPTC样品的ATP含量的荧光素酶的方法,使用的ATP生物发光检测试剂盒HS II(Roche)和制造商的协议。确定在每个样品中的蛋白质浓度,并计算每毫克蛋白。8的 ATP浓度

    13。线粒体形态的可视化

    1. 改变培养基。加入2μl100μM解决方案的的Mitotracker有红580每道菜(终浓度100纳米)和返回的菜的incubator为30分钟。
    2. 检查活的单分子膜5在荧光显微镜下,用水浸物镜。

    14。细胞活力分析

    1. 在开始测定之前,在24小时时,准备50mM的溶液中顺铂治疗,将作为阳性对照,细胞凋亡(膜联蛋白V-阳性细胞)的细胞。另外,准备500 mM的丁基过氧化氢 ​​的溶液中,将作为阳性对照胀亡(碘化丙啶(PI)阳性细胞)的细胞治疗。
    2. 治疗2款2μl的50毫米顺铂和2款2μl的500毫米丁基过氧化氢 ​​。 1碟专用无染控制。
    3. 在治疗与顺铂和TBHP的24小时后,制备的结合缓冲液(的10mM的Hepes,140 mM氯化钠,5mM的氯化钾,1毫摩尔的MgCl 2,1.8毫的CaCl 2)和碘化丙啶(PI)溶液(50微克/毫升)在结合缓冲液中。
    4. 一次洗单分子膜有约束力的BUFF呃。添加1毫升的冰冷的缓冲液中,每个培养皿中,除了无染色和膜联蛋白V-阳性细胞的PI溶液和50μl。包括菜肴和冰上孵育15分钟,温柔的轨道晃动。
    5. 洗净单层用结合缓冲液(10分钟),并加入1毫升的膜联蛋白V-FITC溶液每个培养皿中,除了没有污点和PI阳性细胞的结合缓冲液和2μl。盖菜,并在室温下孵育10分钟,温柔的轨道晃动。
    6. 吸液的缓冲液和洗单层用1ml冰冷的结合缓冲液在冰上10分钟,温和的轨道摇动。重复洗涤步骤。
    7. 吸结合缓冲液,加入500μl结合缓冲液,每道菜。轻轻地刮了的细胞用橡胶警察和转让的细胞,流式细胞仪可检测管。使细胞分散成单细胞悬浮液,通过移液样品向上和向下。分手的细胞团。
    8. 立即FLO量化PI和Annexin V-FITC荧光瓦特仪使用PI和FITC在590和530 nm,激发波长为488 nm,发射。每个样本数为10,000个事件。
    9. 将FITC荧光上的X轴方向和在Y-轴的流式细胞仪散点图数字PI荧光。被认为是细胞凋亡阳性细胞为Annexin V和负PI。被认为是细胞PI和Annexin V的负肿胀。10,11

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    Representative Results

    图1表明,腺病毒交付的cDNA编码的组成型活性(caPKC-ε)和非活动状态(dnPKC-ε)的突变体的PKC-ε的查询结果的显着增加的蛋白水平RPTC和线粒体中的PKC-ε。用cDNA携带caPKC-ε载体感染的细胞过表达PKC-ε的磷酸化形式(有源)而感染的细胞的cDNA编码dnPKC-ε过度表达PKC-ε是不活动的(未磷酸化的)( 图1)。存在的活性PKC-ε降低线粒体呼吸RPTC无论通电线粒体而无效的PKC-ε并无效果( 图2)使用的基板。为了确定的目标活性PKC-ε内的呼吸链,我们确定的呼吸链复合物的所有酶的活动。正如图3所示的图4)。这些变化伴随着跌幅的活动,F 0 F 1-ATP酶(ATP酶)的线粒体从RPTC过度的活动PKC-ε( 图5A)。其结果是,RPTC过度的ATP含量的PKC-ε的活性降低( 图5B)。通过诱导线粒体分裂(分裂)( 图6B),持续激活PKC-ε线粒体的形态产生了深远的影响。 PKC-ε激活,但不能抑制,也造成在RPTC形态的变化,引起细胞的收缩一个第二伸长的细胞存活。线粒体功能障碍和线粒体形态改变在RPTC过度的活性的PKC-ε是伴随着由两个胀亡细胞死亡和细胞凋亡( 图7)。在48小时后的腺病毒载体的交付,约50%的RPTC过度活性的PKC-ε并不可行。过度的无活性形式的PKC-ε并无线粒体功能和形态的影响,和RPTC生存能力。

    因此,腺病毒交付的cDNA编码不同的同工酶PKC是一种有效的工具,能够选择性高表达个人PKC同功酶和活性或非活性的突变体肾细胞的原代培养的。它允许对在原代培养的细胞生长的有效转染,用于研究不同的细胞功能的调节和评估由蛋白激酶的细胞形态和生存能力。

    ENT“FO:保持together.within”页面=“总是”> 图1
    分离的图1。蛋白水平磷酸化的(有源)PKC-ε(对PKC-ε)和总的细胞匀浆中的PKC-ε(左面板)和线粒体(右面板)从RPTC与腺病毒载体的感染的原代培养组成性激活(caPKC-ε)还是非活动状态的突变体(dnPKC-ε)PKC-ε在不同的时间点后腺病毒载体传递。水平的β-肌动蛋白和F 0 F 1-ATP酶的细胞匀浆和线粒体,分别用作凝胶上样控制。图Nowak 。5改性

    图2
    图2状态3和耦合呼吸RPTC表达PKC-ε的活性和非活性的突变体在48小时后腺病毒传递。对于状态3呼吸,毛地黄皂苷-透性细胞线粒体通电使用5mM的谷氨酸+ 5 mM的苹果酸(基板氧化通过复杂的I),10mM的琥珀酸+ 0.1μM鱼藤酮(衬底氧化通过复合物II),或1mM抗坏血酸+ 1个毫摩尔N,N,N',N'-四甲基 - 对 - 苯二胺(TMPD)(基板通过复杂的四氧化)。结果是平均值±SE。 * - P <0.05;

    图3
    图3。活动复杂,我和线粒体复合物IV RPTC表达PKC-ε的活性和非活性的突变体在48小时后腺病毒载体传递。结果是平均值±SE。 * - P <0.05;

    图4
    图4。线粒体膜电位(ΔΨm)在RPTC以下感染与腺病毒载体的组成型活性(caPKC-ε)和非活动的突变体(dnPKC-ε)的PKC-ε中的时间依赖性变化。结果表示作为骨料,以单体形式的JC-1的比率。结果是平均值±SE。 * - P <0.05;

    图5
    图5。活动的F 0 F 1-ATP酶的分离线粒体(A)和ATP含量(B)在RPTC表达PKC-ε的活性和非活性的突变体在48小时后腺病毒载体传递。结果是平均值±SE。 * - P <0.05;

    图6
    图6。现场的RPTC表达PKC-ε的活性和非活性的突变体在48小时后腺病毒载体传递的线粒体形态非感染对照,B。的RPTC表示caPKC-εC。 RPTC表示-εdnPKC。活细胞的代表性图像,在荧光显微镜下检查。放大倍数,X630。

    图7
    在R中的时间依赖性变化如图7所示。PTC胀亡(A)和细胞凋亡(B)的腺病毒载体的组成型活性(caPKC-ε)或无效突变(dnPKC-ε)的PKC-ε以下感染。与空载体pShuttle载体(MOI = 50)进行编码的腺病毒颗粒感染导致5.2±2.3%胀亡和5.5±1.0%,在48小时后感染的细胞凋亡。结果是平均值±SE。 * - P <0.05; C.代表散点图显示RPTC过表达膜联蛋白V和碘化丙啶荧光caPKC-ε和dnPKC-ε48小时后腺病毒载体传递。

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    Discussion

    这里介绍的方法允许个人同工酶的PKC的过度表达在肾小管上皮细胞的原代培养的。这种方法有几个优势:1。它允许在一个同质的人口调查监管机制的细胞(肾小管上皮细胞),各种损伤(缺血,缺氧,氧化应激),药物和nephrotoxicants肾脏内的主要目标。 2。 在体外模型的RPTC生长在原代培养条件的改善线粒体功能,在这个类似于肾近曲小管在体内的线粒体功能。1,2 3。线粒体不同的有毒物质在体外模型是类似的反应在体内的肾脏近端小管。 4。这种方法可以包括蛋白质参与的信号转导中的机械编码特定蛋白质的基因的一个有效的转染和交付短信,调节线粒体的功能。因此,该模型允许组成的active和inactive激酶和磷酸酶的同功酶的选择性表达的和替换不选择性和经常有无毒副作用的的药理抑制剂和活化剂的需要。限制,此模型中有以下几种:1。 在体外环境中培养RPTC不允许用于研究内分泌和旁分泌的信号,有助于在肾近端小管在体内线粒体功能的调节以及2。这种模式不允许进行研究慢性疾病。

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    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgments

    这项工作是由美国国家卫生研究院,美国国立糖尿病,消化和肾脏疾病,2R01DK59558(GN)的资助。 UAMS翻译研究所流式细胞仪核心提供了部分资金支持由国立卫生国家研究资源中心授予UL1 RR029884在UAMS。我们感谢沛沛平博士(加州大学洛杉矶分校,洛杉矶,CA)提供的一份腺病毒携带基因编码的显性负(无效)突变体的PKC-ε和,艾伦博士Samarel(Loyola大学医学中心;梅伍德,IL),用于提供一个等分PKC-ε的组成型活性的突变体的腺病毒载体编码。我们也感谢博士。彼得·帕克和彼得·萨格登(伦敦帝国学院,伦敦,英国)组成性激活PKC-ε的cDNA编码。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    评估肾细胞​​蛋白激酶C同工酶,线粒体功能及细胞活力的
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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