Summary

Vurdering af Mitochondriale funktioner og cellelevedygtighed i Renal celler, der overudtrykker protein kinase C isozymer

Published: January 07, 2013
doi:

Summary

Virkningerne af aktivering af proteinkinase C (PKC) isozymer på mitochondriale som er forbundet med åndedræt og oxidativ phosphorylering og på cellelevedygtighed, er beskrevet. Den fremgangsmåde tilpasser adenoviral teknik til selektivt at overudtrykke PKC-isozymer i primær cellekultur og en række assays til bestemmelse mitochondriale funktioner og energi status af cellen.

Abstract

Proteinkinasen C (PKC) familie af isozymer er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. Vores seneste data viser, at PKC regulerer mitokondriefunktionen og cellulære energi status. Talrige rapporter vist, at aktiveringen af ​​PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriefunktion i iskæmisk hjertesygdom og medierer kardiobeskyttelse. I modsætning hertil har vi vist, at PKC-α-og PKC-ε er involveret i nephrotoxicant-induceret mitokondriel dysfunktion og celledød i nyreceller. Derfor er målet med denne undersøgelse var at udvikle en in vitro model af nyreceller opretholde aktive mitochondriale funktioner, hvor PKC-isozymer kan selektivt aktiveres eller inhiberes at bestemme deres rolle i regulering af oxidativ phosphorylering og celleoverlevelse. Primære kulturer af renale proximale tubulære celler (RPTC) blev dyrket i forbedrede forhold resulterer i mitokondriel respiration og aktiviteten af ​​Mitochondrial enzymer svarende til dem i RPTC in vivo. Fordi traditionelle transfektionsteknikker (Lipofectamin, elektroporering) er ineffektive i primære kulturer og har negative virkninger for mitokondriefunktion blev PKC-ε mutant cDNA'er leveret til RPTC gennem adenovirusvektorer. Denne fremgangsmåde resulterer i transfektion af over 90% dyrket RPTC.

Her præsenteres metoder til at vurdere den rolle, som PKC-ε i: 1. regulering af mitochondrial morfologi og som er forbundet med ATP-syntese, og 2. overlevelse af RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres ved overekspression af konstitutivt aktive PKC-ε mutant. PKC-ε inhiberes af overekspression den inaktive mutant af PKC-ε. Mitokondriefunktion vurderes ved at undersøge respiration, integritet respirationskæden, aktiviteter af respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produktionshastigheden, og ATP indhold. Respiration er enssessed i digitonin-permeabiliserede RPTC som tilstand 3 (maksimal respiration i nærvær af overskydende substrater og ADP) og ukoblede respirations. Integritet af respirationskæden vurderes ved måling af aktiviteter af alle fire komplekser af respirationskæden i isolerede mitokondrier. Kapaciteten af oxidativ phosphorylering vurderes ved måling af mitokondriemembranspændingen, ATP produktionshastigheden, og aktiviteten af F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved at bestemme den intracellulære ATP indhold. Mitochondrial morfologi i levende celler er visualiseret under anvendelse MitoTracker Red 580, et fluorescerende farvestof, som specifikt akkumuleres i mitokondrierne, og levende monolag undersøges under et fluorescensmikroskop. RPTC levedygtighed vurderes ved anvendelse af annexin V / propidiumiodid-farvning efterfulgt af flowcytometri til at bestemme apoptose og oncosis.

Disse fremgangsmåder giver mulighed for en selektiv aktivering / inhibering af individuelle PKC isozymerat vurdere deres rolle i cellulære funktioner i en række fysiologiske og patologiske tilstande, der kan reproduceres in vitro.

Protocol

1. Isolering af nyre proksimale tubuli til primær kultur Anesthetize kanin, punktafgifter begge nyrer og placere dem i en petriskål fyldt med steril prep buffer (DMEM/F12-medium) i en laminar strømning hætte. Perfundere hver nyre med 50 ml prep-puffer efterfulgt af 50 ml steril phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS), og PBS-jernoxid opløsning (45 ml + 5 ml). De-capsulate nyrer og overføre dem til prep buffer indeholdende deferoxamin. Høste cortex af hver nyre. Homogenisere …

Representative Results

Figur 1 viser, adenoviral levering af cDNA, der koder de konstitutivt aktive (caPKC-ε) og inaktive (dnPKC-ε) mutanter af PKC-ε resulterer i signifikant forøgede proteinniveauer af PKC-ε i ​​RPTC og i mitochondria. Celler inficeret med cDNA, der bærer caPKC-ε vektor overudtrykkes den phosphorylerede (aktive) form af PKC-ε hvorimod celler inficeret med cDNA kodende dnPKC-ε overudtrykte PKC-ε, som var inaktivt (ikke phosphoryleret) (figur 1). Tilstedeværelsen af aktivt PKC-?…

Discussion

Den fremgangsmåde, præsenteres her tillader overekspression af individuelle isozymer af PKC i primær kultur af renale proximale tubulære celler. Der er flere styrker af denne fremgangsmåde: 1. Den gør det muligt at undersøge reguleringsmekanismer i en homogen population af celler (nyre proximale tubulære celler), som er det primære mål for forskellige fornærmelser (iskæmi, hypoxi, oxidativ stress), narkotika og nephrotoxicants i nyren. 2. Mitokondrielle funktioner i denne in vitro model af RPTC dyrk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme, 2R01DK59558 (til GN). UAMS Translationel Research Institute støttet af National Institutes of Health National Center for Forskning Ressourcer tilskud UL1 RR029884 giver delvis finansiering af Flowcytometri Core på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for at tilvejebringe en alikvot af adenovirus bærer cDNA kodende den dominerende negative (inaktive) mutant af PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) til tilvejebringelse af en alikvot af adenoviral vektor, der koder den konstitutivt aktive mutant af PKC-ε. Vi takker også Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for at tilvejebringe cDNA kodende konstitutivt aktive PKC-ε.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD
50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 – 15
Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
Circulating Bath YSI Incorporated 5310
KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
Flatbed Recorder Kipp & Zonen BD 11E
48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
Axioskop
Water immersion objective 63x / 0,90W
Carl Zeiss 114846
ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12 Cellgro 99 – 830 – PB
DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 – 1L
Deferoxamine Mesylate Hospira D110
Collagenase Type I Worthington 4196
Trypsin inhibitor Sigma T 6522 – 500mg
5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
Mitotracker Red Invitrogen M22425
ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
Annexin V – FITC solution BioVision 1001 – 200
Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

References

  1. Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
  2. Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
  3. Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
  4. Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
  5. Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
  6. Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
  7. Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
  8. Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
  9. Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
  10. Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
  11. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).

Play Video

Cite This Article
Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

View Video