Vurdering af Mitochondriale funktioner og cellelevedygtighed i Renal celler, der overudtrykker protein kinase C isozymer
Summary
Virkningerne af aktivering af proteinkinase C (PKC) isozymer på mitochondriale som er forbundet med åndedræt og oxidativ phosphorylering og på cellelevedygtighed, er beskrevet. Den fremgangsmåde tilpasser adenoviral teknik til selektivt at overudtrykke PKC-isozymer i primær cellekultur og en række assays til bestemmelse mitochondriale funktioner og energi status af cellen.
Abstract
Proteinkinasen C (PKC) familie af isozymer er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. Vores seneste data viser, at PKC regulerer mitokondriefunktionen og cellulære energi status. Talrige rapporter vist, at aktiveringen af PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriefunktion i iskæmisk hjertesygdom og medierer kardiobeskyttelse. I modsætning hertil har vi vist, at PKC-α-og PKC-ε er involveret i nephrotoxicant-induceret mitokondriel dysfunktion og celledød i nyreceller. Derfor er målet med denne undersøgelse var at udvikle en in vitro model af nyreceller opretholde aktive mitochondriale funktioner, hvor PKC-isozymer kan selektivt aktiveres eller inhiberes at bestemme deres rolle i regulering af oxidativ phosphorylering og celleoverlevelse. Primære kulturer af renale proximale tubulære celler (RPTC) blev dyrket i forbedrede forhold resulterer i mitokondriel respiration og aktiviteten af Mitochondrial enzymer svarende til dem i RPTC in vivo. Fordi traditionelle transfektionsteknikker (Lipofectamin, elektroporering) er ineffektive i primære kulturer og har negative virkninger for mitokondriefunktion blev PKC-ε mutant cDNA'er leveret til RPTC gennem adenovirusvektorer. Denne fremgangsmåde resulterer i transfektion af over 90% dyrket RPTC.
Her præsenteres metoder til at vurdere den rolle, som PKC-ε i: 1. regulering af mitochondrial morfologi og som er forbundet med ATP-syntese, og 2. overlevelse af RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres ved overekspression af konstitutivt aktive PKC-ε mutant. PKC-ε inhiberes af overekspression den inaktive mutant af PKC-ε. Mitokondriefunktion vurderes ved at undersøge respiration, integritet respirationskæden, aktiviteter af respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produktionshastigheden, og ATP indhold. Respiration er enssessed i digitonin-permeabiliserede RPTC som tilstand 3 (maksimal respiration i nærvær af overskydende substrater og ADP) og ukoblede respirations. Integritet af respirationskæden vurderes ved måling af aktiviteter af alle fire komplekser af respirationskæden i isolerede mitokondrier. Kapaciteten af oxidativ phosphorylering vurderes ved måling af mitokondriemembranspændingen, ATP produktionshastigheden, og aktiviteten af F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved at bestemme den intracellulære ATP indhold. Mitochondrial morfologi i levende celler er visualiseret under anvendelse MitoTracker Red 580, et fluorescerende farvestof, som specifikt akkumuleres i mitokondrierne, og levende monolag undersøges under et fluorescensmikroskop. RPTC levedygtighed vurderes ved anvendelse af annexin V / propidiumiodid-farvning efterfulgt af flowcytometri til at bestemme apoptose og oncosis.
Disse fremgangsmåder giver mulighed for en selektiv aktivering / inhibering af individuelle PKC isozymerat vurdere deres rolle i cellulære funktioner i en række fysiologiske og patologiske tilstande, der kan reproduceres in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fremgangsmåde, præsenteres her tillader overekspression af individuelle isozymer af PKC i primær kultur af renale proximale tubulære celler. Der er flere styrker af denne fremgangsmåde: 1. Den gør det muligt at undersøge reguleringsmekanismer i en homogen population af celler (nyre proximale tubulære celler), som er det primære mål for forskellige fornærmelser (iskæmi, hypoxi, oxidativ stress), narkotika og nephrotoxicants i nyren. 2. Mitokondrielle funktioner i denne in vitro model af RPTC dyrk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme, 2R01DK59558 (til GN). UAMS Translationel Research Institute støttet af National Institutes of Health National Center for Forskning Ressourcer tilskud UL1 RR029884 giver delvis finansiering af Flowcytometri Core på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for at tilvejebringe en alikvot af adenovirus bærer cDNA kodende den dominerende negative (inaktive) mutant af PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) til tilvejebringelse af en alikvot af adenoviral vektor, der koder den konstitutivt aktive mutant af PKC-ε. Vi takker også Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for at tilvejebringe cDNA kodende konstitutivt aktive PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
