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Biology

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

Abstract

La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l'attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati ​​o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l'attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta.

Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l'integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F 0 F 1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l'attività di F 0 F 1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis.

Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.

Protocol

1. Isolamento dei tubuli prossimali renali per la cultura primaria

  1. Anestetizzare il coniglio, accise entrambi i reni e metterli in una piastra di Petri riempita con tampone di preparazione sterile (DMEM/F12 media) in una cappa a flusso laminare.
  2. Perfondere ogni rene con 50 ml di tampone prep seguiti da 50 ml di soluzione sterile salina tamponata con fosfato, pH 7,4 (PBS), e la soluzione di PBS-ossido di ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulati reni e trasferirli al buffer di preparazione contenente deferoxamina.
  3. Harvest la corteccia di ciascun rene.
  4. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un ml 15 Dounce omogeneizzatore. Versare l'omogeneizzato in 2 setacci a rete sterili (85 micron nella parte inferiore e 235 micron in alto) poste sopra un bicchiere 1 L sterile. Sciacquare i setacci con deferoxamina contenente buffer.
  5. Raccogliere qualsiasi tessuto lasciato sul setaccio di 85 micron in una provetta sterile da centrifuga conica riempita con 35-40 ml di tampone contenente deferoxamina. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare.
  6. Inserire un forte magnet all'esterno del tubo per rimuovere il ferro riempito glomeruli e lasciare che la sospensione depositarsi. Aspirare ferro dal magnete con una pipetta Pasteur. Ripetere questo processo.
  7. Preparare 1 ml di mezzo di digestione contenente collagenasi 2,400-2,500 unità di I e 0,6 mg di inibitore di tripsina di soia dissolto nel tampone contenente deferoxamina. Filtrare-sterilizzare il mezzo digestione.
  8. Regolare il volume della sospensione cellulare a 40 ml, e aggiungere 1 ml di mezzo di digestione. Incubare a temperatura ambiente per 17 min delicatamente miscelazione della sospensione, centrifugare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C, aspirare il terreno, e aggiungere tampone fresco deferoxamina.
  9. Ripetere la procedura per la rimozione di ferro con il magnete più volte, centrifugare la sospensione di nuovo, aspirare a medio, e aggiungere 46 ml di terreno che non contiene glucosio.
  10. Mescolare delicatamente e misurare 500 microlitri della sospensione in due tubi pre-pesati Eppendorf. Spin celle in basso a 10.000 xg per 1 minuto, aspirare i media, e pesare il pellet. Calcolare il rendimento complessivo della massa umida e proteine.
  11. Piastra le cellule in piatti millimetri sterili 35 di coltura in densità di 1 mg di proteina / piatto con glucosio-free DMEM/F12 media. Cellule di coltura in 2 ml di glucosio terreno privo DMEM/F12 sempre su un agitatore orbitale in incubatore a 37 ° C (95% aria / 5% CO 2). 1,2

2. Renale prossimale Tubulo Colture Cellulari

  1. Il mezzo di coltura è una miscela 50:50 di DMEM e Ham F-12 mix nutrienti senza rosso fenolo, piruvato, e glucosio, supplementato con 15 mM NaHCO 3, 15 mM di HEPES, e 6 lattato mM (pH 7,4, 295 mosmol / KGH 2 O). I supporti sono integrati con L-ascorbico-2-fosfato (50 mM), insulina bovina (10 nM), transferrina umana (5 mg / ml), idrocortisone (50 nM), e selenio (5 ng / ml) immediatamente prima di supporti giornaliero cambiamento.
  2. Aspirare vecchi media da piatti a base di una tecnica sterile. Aggiungere 2 ml di caldo, mezzi freschi per ogni piatto utilizzando una tecnica sterile. Renali cellule del tubulo prossimale (RPTC) raggiungere la confluenza in circa 5-6 giorni dopo la placcatura. 1,2

3. L'infezione adenovirale di RPTC

  1. Infezione adenovirale viene effettuata in colture confluenti, quiescenti di RPTC dopo la variazione giornaliera media. Dominante negativo PKC-ε mutante (dnPKC-ε) è stato costruito dalla sostituzione di: 1) con lisina arginina alla posizione 436 del sito di legame e 2) alanina con glutammato in posizione 159 del dominio pseudosubstrate. Queste mutazioni distrutto l'attività di chinasi del costrutto senza modificare la conformazione attiva della PKC-ε. 3 PKC-ε è stato fatto costitutivamente attivo dalla cancellazione dei residui 154-163 del proprio dominio pseudosubstrate inibitorio 4.
  2. Aggiungere soluzione di riserva della adenovirus portare caPKC-ε cDNA o dnPKC-ε cDNA per ogni piatto per ottenere molteplicità desiderato di infezione (MOI) con conseguente aumento significativo della PKC-& epsilon; livelli di proteine. Incubare RPTC con adenovirus per 24 ore. Modificare i media e le cellule di coltura per un altro 24 h. Livelli significativamente aumentati di fosforilate e totali PKC-ε proteine ​​può essere ottenuta utilizzando 25-50 MOI di vettore adenovirale codificante caPKC-ε. Maggiori risultati in MOI aumenti ancora maggiori dei livelli di attività PKC-ε, ma non è raccomandato in RPTC a causa della rapida morte cellulare e la perdita. Livelli significativamente aumentati di inattive PKC-ε proteina può essere ottenuta utilizzando 50-100 MOI in RPTC senza produrre effetti negativi. 5
  3. A 48 ore dopo l'infezione, i media aspirato, lavare i monostrati con PBS, e raccogliere le cellule per l'analisi immunoblot per determinare i livelli di proteina PKC-ε. 5

4. Misura della respirazione RPTC

  1. Preparare un tampone di saggio per misurare lo stato 3 della respirazione (120 mM KCl, 5 mM KH 2 PO 4, HEPES 10 mM, 1 mM MgSO 4, e 2 mM EGTA, pH 7,4). Per la misurazione del complesso I-accoppiato stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 5 mM glutammato, 5 mM malato e 0,1 mg / ml digitonina. Per complesso II-coupled stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 10 mM succinato, rotenone 0,1 pM, e 0,1 mg / ml digitonina. Per complesso IV-coupled stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 1 mM ascorbato, 1 mM di N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiammina (TMPD), e 0,1 mg / ml digitonina. Mettere le soluzioni in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  2. Aspirare multimediali da un piatto di coltura contenente monostrato RPTC, aggiungere 2 ml di un caloroso stato 3 buffer di respirazione, raschiare delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un poliziotto in gomma, e trasferire la sospensione alla camera di consumo di ossigeno dotato di un Clark-elettrodo.
  3. Misura lo stato 2 respirazione (in assenza di ADP). Avviare stato 3 della respirazione aggiungendo ADP ad una concentrazione finale di 0,4 mM. Avviare stato 4 respirazione aggiungendo oligomicina ad un Conc. finalezione di 0,5 ug / ml. Respirazione disaccoppiata viene misurata aggiungendo 0,5 FCCP pM di cellule respirano allo stato 3. 6,7
  4. Raccogliere la sospensione di cellule dalla camera, precipitato proteico con acido perclorico, e centrifugare il precipitato. Determinare la concentrazione di proteina nel pellet cellulare.

5. Analisi del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm)

  1. Preparare 0,5 mM JC-1 soluzione nel mezzo di coltura sterile.
  2. Aggiungere lentamente 20 ml di soluzione di JC-1 ad ogni piatto per ottenere la concentrazione finale di 5 mM. Agitare il piatto per mescolare accuratamente il colorante. Riportare le piastre nel termostato per 30 minuti.
  3. Mettere i piatti sul ghiaccio, media aspirato, monostrati e lavare due volte con PBS freddo ghiaccio. Aspirare il PBS, aggiungere 1 ml di PBS fresco, raschiare cellule dal piatto e trasferirli in una provetta Eppendorf. Break up monostrati in cellule singole pipettando su e giù.
  4. Centrifugare la sospensione fino a 1.000 xg per 2 minuti, aspirate il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS al pellet e risospendere di ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere l'operazione se necessario.
  5. Spin celle in basso a 1.000 xg per 2 minuti, aspirare il surnatante, aggiungere 0,5 ml di PBS e risospendere il pellet. Analizzare fluorescenza mediante citometria di flusso con eccitazione da un 488 nm argon-laser a ioni. Leggere l'emissione in due canali separati, FL1 a 525 nm ed a 590 nm FL2. Potenziale di membrana mitocondriale è espresso come rapporto di fluorescenza FL2/FL1. 6

6. Isolamento dei mitocondri

  1. Preparare i buffer di isolamento: tampone A (10 mM HEPES, 225 mM mannitolo, saccarosio 75 mM, EGTA 0,1 mM, pH 7,4), Tampone B (tampone A contenente inibitori delle proteasi, 1 mM Na VO 3 4, 1 mM NaF), e Buffer C (HEPES 10 mM, saccarosio 395 mM, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio.
  2. Lavare due volte con monostrati RPTC ghiacciata PBS. Raschiare monostrati in provette Eppendorf e spina 500 xg per 5 min. Lavare il pellet in 1 ml di tampone A.
  3. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone B, e trasferire la sospensione in un 2 ml Dounce omogeneizzatore.
  4. Omogeneizzare cellule nel omogeneizzatore Dounce finché la maggior parte delle cellule del omogenato sono rotti quando controllati al microscopio.
  5. Centrifugare l'omogeneizzato a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e spin giù a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  6. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet greggio contenente mitocondri in 1 ml di tampone C. Spin supernatanti giù a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere il lavaggio dei due tempi a pellet più 5.
  7. Per misurare le attività dei complessi respiratori, risospendere pellet mitocondriale in 50-100 microlitri del tampone di saggio e congelamento in azoto liquido. Scongelare i campioni lentamente sul ghiaccio.

7. Misura di attività della NADH-ubichinone ossidoreduttasi (Complesso I)

  1. Preparare il tampone di saggio: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Aggiungi acidi grassi senza BSA e NADH per ottenere concentrazioni finali di 0,25% e 0,25 mm, rispettivamente. Aggiungere 2 ml di soluzione di Antimicina A (1 mg / ml) ad una concentrazione finale di 2 mg / ml.
  2. Eseguire i campioni a 48-pozzetti trasparente. Includere un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto, aggiungere 500 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
  3. Avviare la reazione aggiungendo 10 pl di ubichinone 3,25 mM a ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (340 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 5 ml di soluzione di rotenone (1 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per ulteriori 2 min. Calcola il complesso I come il rotenone sensibile all'ossidazione NADH 7.

8. Misura di attività della succinato-ubichinone ossidoreduttasi (Complesso II)

Preparare il tampone di dosaggio contenente 0,25% di acido grasso privo di BSA, succinato di potassio 20 mM, 0,25 mM 2,6-dichloroindophenol, 2 ug / ml antimicina A, e 10 ug / ml rotenone.
  • Eseguire i campioni in duplicato in 48 pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto, aggiungere 500 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 2 min.
  • Avviare la reazione aggiungendo 10 pl di ubichinone 3,25 mM a ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (595 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Calcola attività del complesso II in seguito alla riduzione di 2,6-dichloroindophenol 7.
  • 9. Misura di attività di ubiquinolo-citocromo c ossidoreduttasi (Complesso III)

    1. Preparare il tampone di analisi contenente 0,1% di acido grasso privo di BSA, succinato di potassio 80 mM, 10 pg / ml rotenone, e 0,24 mM cianuro di potassio.
    2. Eseguire i campioniin duplice esemplare a 48 pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto 291 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
    3. Avviare la reazione aggiungendo 3 ml di 6 mM ossidato citocromo c in ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (550 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 5 ml di soluzione di Antimicina A (1 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per ulteriori 2 min. Calcola complessa attività III A-sensibile riduzione antimicina citocromo c 7.

    10. Misura di attività della citocromo ossidasi (Complesso IV)

    1. Preparare ridotti citocromo c aggiungendo ascorbato di sodio a 9 mM soluzione di citocromo c dialisi e la soluzione per una notte a 4 ° C in 1 L di tampone fosfato (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) contenente 5 mM MgCl 2. Preparare il tampone di dosaggio contenente0,1% di acido grasso privo di BSA e antimicina A (2 mg / ml).
    2. Eseguire i campioni a 48-pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto 233 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
    3. Avviare la reazione aggiungendo ridotta citocromo c (90 pM concentrazione finale). Registrare l'assorbanza (550 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 2 ml di soluzione di KCN (8 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per altri 2 minuti. Calcola complessa attività IV, secondo il KCN sensibile ossidazione citocromo c 7.

    11. Misura di attività di F 0 F 1-ATPasi (ATP sintasi)

    1. Preparare F 0 F 1-ATPasi tampone di saggio (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8,2). Risospendere pellet mitocondriale nel tampone di saggio, congelare i campioni mitocondriali in liquidazioned azoto e scongelare i campioni lentamente sul ghiaccio.
    2. Eseguire gli esempi in triplice copia in un 48-pozzetti trasparente. Per ciascun gruppo di trattamento, 2 pozzi verrà eseguito per misurare l'attività totale ATPasi (275 microlitri del tampone di saggio, 5 microlitri di sospensione mitocondriale, e 5 ml di etanolo al 95%) ed 1 pozzetto per misurare oligomicina-insensitive ATPasi (275 pl di il tampone di saggio, 5 microlitri di sospensione mitocondriale, e 5 microlitri di 1 mg / ml soluzione oligomicina in 95% etanolo).
    3. Incubare i campioni a 31 ° C per 10 minuti con agitazione costante. Aggiungere 16 ml di soluzione 100 mM ATP (pH 7,0) e incubare a 31 ° C per 5 minuti con agitazione costante.
    4. Trasferire 200 microlitri della miscela di incubazione in una provetta contenente 50 ml di 3 M TCA. Incubare campioni in ghiaccio per 10 min e spin giù a 10.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Utilizzare supernatanti e pellet per determinare fosfato e contenuto proteico, rispettivamente.
    5. Determinare il contenuto di fosfato nel supernatante utilizzando l'fosfato inorganico dosaggio. Preparare 100 ml di reagente Sumner aggiungendo 0,88 g FeSO 4 a 10 ml di 3,75 MH 2 SO 4 e regolando a 90 ml con H 2 O. Aggiungere 10 ml di soluzione di molibdato di ammonio (0,66 g/10 ml H 2 O) alla soluzione di FeSO 4 in H 2 SO 4. Proteggere dalla luce.
    6. Carico piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di ogni standard fosfato (0 - 1.000 pM KH 2 PO 4) e 50 pl di ciascun supernatante in duplicati. Aggiungere 250 microlitri di reagente Sumner in ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 30 ° C per 15 minuti con agitazione costante.
    7. Registrare l'assorbanza a 595 nm a temperatura ambiente. F 0 F 1-ATPasi è determinata misurando la oligomicina sensibile rilascio di P i da ATP come descritto in precedenza. 7,8 Calcolo totale e oligomicina-insensitive F 0 F 1-ATPasi attività. Per calcolare il oligomicina sensibile ATPasi actività, sottrarre oligomicina-insensitive attività dal ATPasi totale. 8,9

    12. Misurazione di contenuto intracellulare ATP

    1. Luogo piastre di coltura contenenti monostrati RPTC su ghiaccio, medie aspirato, e lavare i monostrati due volte con tampone PBS freddo ghiaccio. Aggiungere 1 ml di PBS per ciascun monostrato, raschiare ciascun monostrato in PBS, e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta Eppendorf. Spin le provette Eppendorf in microcentrifuga per 5 sec.
    2. Determinare il contenuto di ATP in ciascun campione RPTC dal metodo luciferasi utilizzando la bioluminescenza ATP Assay Kit HS II (Roche) e il protocollo del produttore. Determinare la concentrazione di proteina in ciascun campione e calcolare la concentrazione di ATP per mg di proteina. 8

    13. Visualizzazione di Morfologia mitocondriale

    1. Cambia terreni di coltura. Aggiungere 2 ml di soluzione 100 mM di MitoTracker Red 580 a ogni piatto (conc finale. 100 nM) e restituire i piatti al incubator per 30 min.
    2. Esaminare i monostrati vivere sotto un microscopio a fluorescenza con un obiettivo di immersione in acqua 5.

    14. Analisi della vitalità cellulare

    1. A 24 ore prima di iniziare il test preparare 50ml di soluzione mM di cisplatino per il trattamento di cellule che serviranno come controllo positivo per l'apoptosi (annessina V-positive cellule). Inoltre, preparare una soluzione 500 mM di tert-butilidroperossido per il trattamento di cellule che serviranno come controlli positivi per oncosis (ioduro di propidio cellule positive).
    2. Trattare 2 piatti con 2 ml di 50 mM cisplatino e 2 piatti con 2 ml di 500 mM terz-butilidroperossido. Dedicare 1 piatto per un no-macchia controllo.
    3. A 24 ore dopo il trattamento con cisplatino e TBHP, preparare il tampone di legame (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2) e ioduro di propidio (PI) soluzione (50 mg / ml) nel tampone di legame.
    4. Lavare monostrati una volta con il buff vincolanteer. Aggiungere 1 ml di tampone ghiacciato e 50 pl di soluzione di PI per ogni piatto tranne per i non-macchia e annessina V-positive cellule. Coprire i piatti e incubare in ghiaccio per 15 minuti con gentile agitazione orbitale.
    5. Lavare monostrati con il tampone di legame (10 min) e aggiungere 1 ml di tampone di legame e 2 microlitri di annessina V-FITC soluzione per ogni piatto tranne per cellule non-macchia e PI-positive. Coprire i piatti e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con delicata agitazione orbitale.
    6. Aspirare il tampone e lavare i monostrati con 1 ml di tampone ghiacciato vincolante in ghiaccio per 10 min con delicata agitazione orbitale. Ripetere la fase di lavaggio.
    7. Aspirare il tampone di legame e aggiungere 500 ml di tampone di legame per ogni piatto. Raschiare delicatamente le cellule utilizzando un poliziotto in gomma e trasferire le cellule a scorrere i tubi di citometria. Disperdere le cellule in una sospensione di cellule singole pipettando campioni su e giù. Suddividere i cluster cellulari.
    8. Quantificare PI e annessina V-FITC immediatamente flocitometria w usando eccitazione a 488 nm ed emissione a 590 e 530 nm per PI e FITC, rispettivamente. Conta 10.000 eventi per ciascun campione.
    9. Mettere la fluorescenza FITC sulla asse X e la fluorescenza PI sulla Y dei citometria figure dot plot. Cellule positive per annessina V e negativo per PI sono considerati apoptotico. Le cellule positive per PI e negativo per annessina V sono considerati oncotica. 10,11

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    Representative Results

    La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine ​​significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1). La presenza attiva di PKC-ε diminuita respirazione mitocondriale in RPTC indipendentemente dal substrato usato per eccitare mitocondri mentre il inattiva PKC-ε non ha avuto effetto (Figura 2). Per determinare gli obiettivi del attiva PKC-ε all'interno della catena respiratoria, abbiamo determinato le attività di tutti i complessi enzimatici della catena respiratoria. Come mostrato in figura 3 (Figura 4). Questi cambiamenti sono stati accompagnati da una diminuzione della attività di F 0 F 1-ATPasi (ATP sintasi) nei mitocondri isolati da RPTC overexpressing attiva PKC-ε (Figura 5A). Come risultato, il contenuto di ATP RPTC sovraesprimono la attiva PKC-ε diminuita (figura 5B). Sostenuta attivazione di PKC-ε ha avuto profondi effetti sulla morfologia mitocondriale inducendo frammentazione mitocondriale (fissione) (Figura 6B). Inibizione della PKC-ε attivazione, ma non, anche comportato dei cambiamenti nella morfologia RPTC provocando un restringimento delle cellule nd allungamento delle cellule sopravvissute. Disfunzione mitocondriale ed alterazioni nella morfologia mitocondriale in RPTC sovraesprimono la attiva PKC-ε state accompagnate da morte cellulare per apoptosi e sia oncosis (Figura 7). A 48 ore dopo la consegna vettore adenovirale, circa il 50% del RPTC sovraesprimono la attiva PKC-ε non erano vitali. Sovraespressione della forma inattiva della PKC-ε non ha avuto effetto sulla funzione mitocondriale e la morfologia, e sulla vitalità RPTC.

    Così, la consegna adenovirale di cDNA codificanti diversi isoenzimi di PKC è uno strumento efficace che consente l'iperespressione selettiva di singoli isoenzimi PKC e dei loro mutanti attivi o inattivi in ​​colture primarie di cellule renali. Esso permette di trasfezione efficiente di cellule in coltura primaria e per studiare la regolazione di diverse funzioni cellulari e per la valutazione della morfologia cellulare e la vitalità dalla proteina chinasi.

    ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
    Figura 1. Livelli proteici della fosforilata (attiva) PKC-ε (p-PKC-ε) e totale PKC-ε in omogenati cellulari (pannello di sinistra) e mitocondri (pannello destro) isolati da colture primarie di RPTC infettate con il vettore adenovirale portando mutanti costitutivamente attivi (caPKC-ε) o inattivo (dnPKC-ε) di PKC-ε a tempi diversi dopo la consegna vettore adenovirale. I livelli di β-actina e F 0 F 1-ATPasi sono utilizzati come controlli caricamento del gel per omogenati cellulari e mitocondri, rispettivamente. Figura modificato da Nowak et al. 5

    Figura 2
    Figura 2. Stato3 e disaccoppiato respirazioni in RPTC esprimere i mutanti attivi e inattivi di PKC-ε a 48 ore dopo la consegna adenovirale. Per stato 3 respirazione, mitocondri in digitonina-permeabilizzate cellule sono state alimentato con 5 mM glutammato + 5 mM malato (substrati ossidati mediante complesso I), 10 mM succinato + 0,1 rotenone pM (substrato ossidato attraverso complesso II), o 1 mM ascorbato + 1 mM N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiammina (TMPD) (substrati ossidati mediante complesso IV). I risultati sono la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 3
    Figura 3. Attività del complesso I e IV complesso in mitocondri isolati da RPTC esprimere i mutanti attiva e inattiva PKC-ε a 48 ore dopo la consegna vettore adenovirale. I risultati sono la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 4
    Figura 4. Dipendenti dal tempo variazioni di potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) in RPTC dopo l'infezione con vettore adenovirale portando i mutanti costitutivamente attivi (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) di PKC-ε. I risultati sono espressi come rapporto di aggregazione a forme monomeriche di JC-1. I risultati sono la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 5
    Figura 5. Attività di F 0 F 1-ATPasi in mitocondri isolati (A) e il contenuto di ATP (B)in RPTC esprimere i mutanti attivi e inattivi di PKC-ε a 48 ore dopo la consegna vettore adenovirale. I risultati sono la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 6
    Figura 6. Morfologia mitocondriale in vivo RPTC esprimere i mutanti attiva e inattiva PKC-ε a 48 ore dopo la consegna vettore adenovirale. A. Non infetti controlli. B. RPTC esprimendo caPKC-ε. C. RPTC esprimendo dnPKC-ε. Immagini rappresentative della cellule vive esaminato al microscopio a fluorescenza. Ingrandimento originale, X630.

    Figura 7
    Figura 7. Tempo-dipendenti variazioni RPTC oncosis (A) e l'apoptosi (B) dopo l'infezione con vettore adenovirale portante i mutanti costitutivamente attivi (caPKC-ε) o inattivo (dnPKC-ε) di PKC-ε. L'infezione con particelle adenovirali codificanti un vettore vuoto pShuttle (MOI = 50) è risultato in 5,2 ± 2,3% e il 5,5 oncosis ± 1,0% apoptosi a 48 ore dopo l'infezione. I risultati sono la media ± SE. * - P <0,05. C. rappresentativi dot plot che dimostrano annessina V e ioduro di propidio in fluorescenza RPTC sovraespressione caPKC-ε e dnPKC-ε a 48 ore dopo la consegna vettore adenovirale.

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    Discussion

    L'approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l'obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all'interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vitro di RPTC crescere in coltura primaria nelle condizioni migliori assomigliano funzioni mitocondriali di tubuli prossimali renali in vivo. 1,2 3. Risposta dei mitocondri agli agenti tossici differenti in questo modello in vitro è simile alla risposta di tubuli prossimali renali in vivo. 4. Questo approccio consente una trasfezione efficienti dei geni codificanti proteine ​​specifiche incluse proteine ​​coinvolte nella trasduzione del segnale meccanicosms che regolano le funzioni mitocondriali. Pertanto, questo modello permette l'espressione selettiva di isoenzimi costitutivamente attivi e inattivi chinasi e fosfatasi e sostituisce l'esigenza di inibitori farmacologici e attivatori che non sono selettive e spesso hanno effetti collaterali tossici. I limiti di questo modello sono i seguenti: 1. utilizzando RPTC coltivate in un ambiente in vitro non consente lo studio endocrino e segnali paracrini che contribuiscono alla regolazione della funzione mitocondriale in renale tubuli prossimali in vivo, e 2. questo modello non permette di studiare le malattie croniche.

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    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali, 2R01DK59558 (a GN). MSNA Translational Research Institute sostenuto dal National Institutes of Health Centro Nazionale per la Ricerca Risorse concessione UL1 RR029884 fornito un finanziamento parziale per Core Citometria a Flusso di MSNA. Ringraziamo il Dott. Peipei Ping (Università di California a Los Angeles, Los Angeles, CA) per fornire un 'aliquota di adenovirus portare cDNA codificante il dominante negativo (inattivo) mutante della PKC-ε e il dottor Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) per fornire una aliquota di vettore adenovirale codificante mutante costitutivamente attivo di PKC-ε. Ringraziamo anche Drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, Londra, Regno Unito) per la fornitura di cDNA codificante costitutivamente attivi PKC-ε.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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