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Biology

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

Abstract

isozymes의 단백질 키나제 C (PKC) 가족 여러 생리 학적 및 병리학 과정에 참여하고 있습니다. 최근 데이터는 PKC는 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 조절하는 보여줍니다. 많은 보고서는 PKC-a와 PKC-ε의 활성화는 허혈성 심장과 mediates의 cardioprotection에서 mitochondrial 기능을 향상 보여 주었다. 반면에, 우리는 PKC-α와 PKC-ε은 신장 세포에서 nephrotoxicant 유발 mitochondrial 장애 및 세포 죽음에 연루되어 보여주고 있습니다. 따라서, 본 연구의 목표는 PKC의 isozymes가 선택적으로 활성화 또는 산화 인산화와 세포 생존의 규정에서 자신의 역할을 결정하기 위해 저해 할 수있는 활성 mitochondrial 기능을 유지하는 신장 세포의 체외 모델을 개발하는 것이 었습니다. 신장 근위 관 세포 (RPTC)의 기본 문화는 미토의 mitochondrial 호흡과 활동의 결과로 개선 된 조건에서 배양 된생체 내 RPTC에서 비슷한 chondrial 효소. 전통 transfection 기술 (Lipofectamine, electroporation)가 기본 문화에 비효율적이며, mitochondrial 기능에 부정적 영향을 미칠 때문에, PKC-ε 돌연변이 cDNAs가 adenoviral 벡터를 통해 RPTC에게 전달했다. % 90 교양 RPTC의 transfection에있는이 방법은 결과를 표시합니다.

여기, 우리는에서 PKC-ε의 역할을 평가하기위한 방법을 제시 1. mitochondrial 형태와 ATP 합성, 2와 관련된 기능을 규제. 차 문화에 RPTC의 생존. PKC-ε는 overexpressing constitutively 활성화 PKC-ε 돌연변이에 의해 활성화됩니다. PKC-ε는 overexpressing에 의해 PKC-ε의 비활성 돌연변이를 억제하고 있습니다. Mitochondrial 기능, 호흡 단지 및 활동을 호흡기 체인의 무결성을 호흡을 검토하여 평가된다 F 0 F 1 ATPase, ATP 생산 속도, 및 ATP의 콘텐츠입니다. 호흡은주 3 일 (초과 기판과 ADP의 존재의 최대 호흡)와 uncoupled 호흡으로 digitonin-permeabilized RPTC에 ssessed. 호흡기 체인의 무결성은 절연 된 미토콘드리아의 호흡 체인의 네 가지 단지의 활동을 측정하여 평가된다. 산화 인산화의 용량은 F 0 F 1 ATPase의 ATP 생산 속도, 활동, mitochondrial 막 잠재력을 측정하여 평가됩니다. RPTC의 에너지 상태가 세포 내 ATP 내용을 결정함으로써 평가된다. 라이브 셀의 Mitochondrial 형태는 MitoTracker 레드 580, 특히 미토콘드리아에 축적 형광 염료, 라이브 monolayers 형광 현미경으로 검사 아르를 사용하여 시각화합니다. RPTC 가능성은 annexin V / apoptosis 및 oncosis을 결정하는 유동 세포 계측법에 이어 propidium의 요오드화물 착색를 사용하여 평가된다.

이러한 방법은 각각의 PKC isozymes의 선택적 활성화 / 억제 할 수 있도록체외의에 복제 할 수 있습니다 생리학 및 병리학 조건 다양한 세포 기능에서 자신의 역할을 평가합니다.

Protocol

1. 차 문화 신장 근위 Tubules의 절연

  1. 토끼, 소비세 모두 신장을 마취하고 층류 후드의 무균 시험을 치루 버퍼 (DMEM/F12 매체)로 가득 찬 페트리 접시에 배치합니다.
  2. 멸균 50 ML에 이어 사립 버퍼의 50 ML 각 신장을 Perfuse 생리, 산도에게 7.4 (PBS)를 인산염은 버퍼, 그리고 PBS 철 산화물 솔루션 (45 ML + 5 ML). 신장을 드 - capsulate와 deferoxamine를 포함하는 사립 버퍼로 전송할 수 있습니다.
  3. 각 신장의 피질을 수확.
  4. 15 ML 다운스 호 모지 나이저를 사용하여 조직을 균질화. 1 L 멸균 비이커 위에 위치 2 무균 메쉬 sieves (바닥에 85 μm 및 상단에 235 μm)를 통해 homogenate 하거라. deferoxamine 함유 버퍼로 sieves를 씻어.
  5. deferoxamine 함유 버퍼의 35-40 ML로 가득 살균 원뿔 원심 분리기 관에 85 μm의 체에 남아있는 조직을 수집합니다. 부드럽게 세포 현탁액을 섞는다.
  6. 강력한 m를 배치관의 외부 agnet는 glomeruli을 가득 철을 제거하고 정지 정착하게합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 자석에서 철을 대기음. 이 과정을 반복합니다.
  7. collagenase I와 deferoxamine 함유 버퍼에 용해 0.6 MG의 콩 트립신 억제제의 2,400-2,500 단위를 포함하는 소화 매체 1 ML을 준비합니다. 소화 매체를 필터 소독.
  8. 40 ML에 세포 현탁액의 볼륨을 조정하고 소화 매체 1 ML를 추가합니다. 17 분은 가볍게 4에 2 분 ° C 50 XG에서 원심 분리기를 정지 혼합 동안 실온에서 알을 품다, 매체를 대기음, 신선한 deferoxamine 버퍼를 추가합니다.
  9. 반복 철 - 제거 자석으로 여러 번 절차를 다시 아래로 정지 스핀 매체를 대기음, 그리고 더 포도당을 포함하지 중간 46 ML를 추가합니다.주세요
  10. 부드럽게 믹스와 두 개의 미리 무게 Eppendorf 튜브에 정지 500 μl를 측정합니다. 1 분에 10,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 미디어를 기음과 펠릿의 무게. 서부 유럽 표준시 질량과 단백질의 총 수율을 계산합니다.
  11. 한 MG 단백질 / 포도당 무료 DMEM/F12 매체를 사용하여 요리의 밀도에서 무균 35mm 문화 요리에 플레이트 세포. 37 ° C (95% 공기 / 5 % CO 2)에 보육의 궤도 셰이커에 항상 두 ML 포도당 무료 DMEM/F12 매체의 문화 세포. 1,2

2. 신장 근위 가느 다란 관의 세포 배양

  1. 문화 매체는 15 MM NaHCO 3, 15 밀리미터 HEPES, 6 MM 락트산 (산도 7.4, 295 mosmol / kgH을 보충 DMEM과 햄의 페놀 빨강, pyruvate, 그리고 포도당이없는 F-12 영양소 혼합의 50:50 혼합물입니다 2 O). 미디어는 L-아스코르브 산-2-인산 (50 μM), 소 인슐린 (10 NM), 인간 트랜스페린 (5 MG / ML), 하이드로 코티손 (50 NM) 및 셀레늄 (5 NG / ML) 바로 앞에와 보충 아르 매일 미디어 변화.
  2. 무균 기술을 사용하여 요리의 이전 미디어를 대기음. 무균 기술을 사용하여 각 음식을 따뜻하게, 신선한 미디어 2 ML을 추가합니다. 다시NAL 근위 관 세포 (RPTC)는 도금 후 약 5~6일에 합류에게 다가 갈 수 있습니다. 1,2

3. RPTC의 Adenoviral 감염

  1. Adenoviral 감염은 매일 미디어 변경 한 후 RPTC의 합류, 동작 문화에 수행됩니다. 지배적 인 부정적 PKC-ε 돌연변이가 (dnPKC-ε)의 교체에 의해 건설되었습니다 : 1) ATP 바인딩 사이트와 pseudosubstrate 도메인의 2) 위치에서 glutamate와 알라닌 159의 위치 436에서 아르기닌과 리신. 이러한 돌연변이는 PKC-ε의 활성 형태를 변경하지 않고 구조의 키나제의 활동을 파괴. 3 PKC-ε은 해당 억제 pseudosubstrate 도메인의 잔류 154-163의 삭제에 의해 constitutively 활성화되었다 4.
  2. PKC-& epsil 크게 증가의 결과로 감염의 원하는 다양성을 (나 역시)을 획득 할 각 요리에 caPKC-ε cDNA 또는 dnPKC-ε cDNA 들고 아데노 바이러스의 주식 솔루션을 추가에, 단백질 수준. 24 시간에 대한 아데노 바이러스와 RPTC을 품다. 또 다른 24 시간을위한 미디어 및 문화 셀을 변경합니다. phosphorylated, 총 PKC-ε 단백질의 크게 증가 수준은 adenoviral 벡터 caPKC-ε 코딩의 25-50 전부다을 사용하여 얻을 수 있습니다. 활성 PKC-ε의 수준에서 더 큰 증가에 큰 나 역시 결과는 있지만 급속한 세포 죽음과 손실로 인해 RPTC에 권장하지 않습니다. 비활성 PKC-ε 단백질의 크게 증가 수준은 부작용을 생산하지 않고 RPTC에 나 역시 50-100를 사용하여 얻을 수 있습니다. 5
  3. 감염 후 48 시간에서 대기음 매체는, PBS로 monolayers을 씻고, 그리고 PKC-ε의 단백질 수준을 결정하기 위해 immunoblot 분석을위한 세포를 수집합니다. 5

4. RPTC 호흡 측정

  1. 주에게 3 호흡 (120 MM KCl, 5 MM KH 2 PO 4, 10 밀리미터 HEPES, 1 MM MgSO 4, 2 밀리미터 EG을 측정하기위한 분석 버퍼를 준비TA, 산도 7.4). 복잡한 I-커플 링 주 3 호흡을 측정하는, 5 밀리미터 glutamate, 5 MM 말라 테와 0.1 MG / ML digitonin으로 분석 완충액을 보완. 복잡한 II - 결합 상태를 세 호흡를 들어, 10 MM 호박산, 0.1 μM의 rotenone, 그리고 0.1 MG / ML digitonin으로 분석 완충액을 보완. 복잡한 IV-결합 상태를 세 호흡를 들어, 1 ㎜의 아스 코브 산, 1 MM N, N, N ', N'-tetramethyl-P-phenylenediamine (TMPD) 및 0.1 MG / ML digitonin으로 분석 완충액을 보완. 37 ° C의 물을 욕조에 솔루션을 배치합니다.
  2. RPTC의 monolayer가 포함 된 배양 접시에서 미디어를 대기음, 따뜻한 상태 3 호흡 버퍼 2 ML를 추가 부드럽게 고무 경찰관을 사용하여 요리에서 세포를 긁어와 클락 형 전극이 장착 된 산소 소비 챔버에 정지 전송합니다.
  3. 측정 상태 2 호흡 (ADP의 부재에서). 0.4 mm의 최종 농도에 ADP를 추가하여 주 3 호흡을 시작합니다. 최종 concentr에 oligomycin을 추가하여 주 4 호흡을 시작0.5 μg / ML의 ation. Uncoupled 호흡은 주 3에 respiring 셀에 0.5 μM의 FCCP을 추가하여 측정됩니다. 6,7
  4. , 챔버에서 세포 현탁액을 수집 perchloric 산성을 사용하여 단백질을 침전하고, 침전물을 스핀 다운. 세포 펠렛의 단백질 농도를 결정합니다.

5. Mitochondrial 막전위의 분석 (ΔΨm)

  1. 무균 배지에서 JC-1 솔루션 0.5 MM를 준비합니다.
  2. 5 μm의 최종 농도를 얻기 위해 각 요리에 JC-1 솔루션의 천천히 20 μl를 추가합니다. 소용돌이 요리는 철저하게 염료를 혼합합니다. 30 분의 보육에 요리를 반환합니다.
  3. 얼음, 기음 미디어에 요리를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 monolayers을 씻는다. 대기음 PBS는 신선한 PBS 1 ML을 추가 요리에서 세포를 긁어 Eppendorf 튜브로 전송할 수 있습니다. 올려 pipetting 아래로하여 하나의 셀에 monolayers을 해봐.
  4. 2 분, ASP 1,000 XG에서 정지 스핀 다운표면에 뜨는을 화나게, 펠릿에 PBS 1 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 다시 일시 중지합니다. 필요한 경우 다시이 단계를 반복합니다.
  5. 2 분 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 표면에 뜨는을 대기음 PBS의 0.5 ML을 추가하고 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 488-nm의 아르곤 이온 레이저로 여기를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 형광을 분석합니다. 두 개의 채널, 590 nm의에서 525 nm의에서 FL1과 FL2의 방출을 참조하십시오. Mitochondrial 막 잠재력은 FL2/FL1 형광의 비율로 표시됩니다. 6

6. 미토콘드리아의 절연

  1. 절연 버퍼를 준비 : 버퍼 (10 MM의 HEPES, 225 MM 마니 톨, 75 밀리미터 자당, 0.1 MM EGTA, 산도 7.4), 버퍼 B (버퍼가 포함 된 단백 분해 효소 억제제, 1 MM 오세영 3 VO 4, 1 ㎜ NaF), 그리고 버퍼 C (10 밀리미터 HEPES, 395 밀리미터 자당, 0.1 MM EGTA, 산도 7.4). 얼음의 모든 단계를 수행합니다.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 두 번 RPTC monolayers을 씻는다. Eppendorf 튜브에 monolayers을 다쳤고, 그리고 그것들을 돌리다5 분 500 XG에서. 버퍼 A. 1 ML에있는 펠릿을 씻으십시오
  3. 버퍼 B의 1 ML에있는 펠릿을 다시 중지하고, 2 ML 다운스 호 모지 나이저로 정지 전송합니다.
  4. 현미경으로 검사하면 homogenate에서 세포의 대부분이 부러 때까지 다운스 호 모지 나이저의의 세포를 균질화.
  5. 4 ° C.에서 5 분 1,000 XG에서 homogenate를 원심 분리기 4에 표면에 뜨는를 수집하고 10 분 동안 15,000 XG에서 내려 스핀 ° C.
  6. 표면에 뜨는을 취소하고 버퍼 C. 1 ML에서 4시 10 분에 15,000 XG에서 supernatants을 돌려 펠릿이 포함 된 원유는 미토콘드리아 다시 중단 ° C. 펠렛 두 배의 씻음을 반복 5.
  7. 호흡기 단지의 활동을 측정하기 위해 액체 질소에 검정 버퍼와 동결의 50-100 μl에 mitochondrial 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 얼음에 천천히 샘플을 해동.

7. NADH - ubiquinone의 산화 환원 효소의 활동 측정 (복합 I)

  1. 10 MM KH 2 PO 4, 5 MM MgCl 2, 산도 7.2 : 검정 버퍼를 준비합니다. 각각 최종 0.25 %의 농도 및 0.25 MM를 얻기 위해 지방산 무료 BSA와 NADH를 추가합니다. 2 μg / ML의 최종 농도에 antimycin 솔루션 (1 MG / ML) 2 μl를 추가합니다.
  2. 48 잘 투명 판에 샘플을 실행합니다. 모든 추가 있지만 미토콘드리아가 빈 샘플을 포함합니다. 각도에, 추가 및 미토콘드리아로 분석 완충액 500 μl를 추가하고 5 분을 위해 혼합으로 30 ° C에서 판을 품다.
  3. 각도에 3.25 밀리미터 ubiquinone의 10 μl를 추가하여 반응을 시작합니다. 20 초 간격의 3 분의 흡광도 (340 nm 정도)를 기록합니다. 각 잘에 rotenone 솔루션의 5 μl (1 MG / ML) 추가 및 추가 2 분의 흡광도를 기록합니다. rotenone에 민감한 NADH 산화와 같은 복잡한 I 활동을 계산할 수 있습니다. 7

8. 호박산-ubiquinone의 산화 환원 효소의 활동 측정 (복합 II)

0.25 % 지방산 무료 BSA, 20 MM의 칼륨 호박산, 2,6 - dichloroindophenol 0.25 MM, 2 μg / ML antimycin A, 및 10 μg / ML의 rotenone을 포함하는 검정 버퍼를 준비합니다.
  • 모든 추가 있지만 미토콘드리아가 빈 샘플을 포함하여 48도 투명 판에 중복으로 샘플을 실행합니다. 각도에, 추가 및 미토콘드리아로 분석 완충액 500 μl를 추가하고 2 분을 위해 혼합으로 30 ° C에서 판을 품다.
  • 각도에 3.25 밀리미터 ubiquinone의 10 μl를 추가하여 반응을 시작합니다. 20 초 간격의 3 분의 흡광도 (595 nm 정도)를 기록합니다. 2,6 - dichloroindophenol의 감소에 따라 복잡한 II 활동을 계산할 수 있습니다. 7
  • 9. Ubiquinol - 시토크롬 C 산화 환원 효소의 활동 측정 (복합 III)

    1. 청산가리 0.1 % 지방산 무료 BSA, 80 MM의 칼륨 호박산, 10 μg / ML rotenone, 그리고 0.24 MM의 칼륨을 포함하는 검정 버퍼를 준비합니다.
    2. 샘플을 실행모든 추가 있지만 미토콘드리아가 빈 샘플을 포함하여 48도 투명 판에 중복 인치 각도에, 추가 및 미토콘드리아로 분석 버퍼의 291 μl를 추가하고 5 분을 위해 혼합으로 30 ° C에서 판을 품다.
    3. 각도에 시토크롬 C를 산화 6 MM 3 μl를 추가하여 반응을 시작합니다. 20 초 간격의 3 분의 흡광도 (550 nm 정도)를 기록합니다. 각도에 antimycin 솔루션 (1 MG / ML)의 5 μl를 추가하고 추가 2 분의 흡광도를 기록합니다. antimycin A-민감한 시토크롬 C 감소 7. 같은 복잡한 III 활동을 계산

    10. 시토크롬 산화 효소의 활동 측정 (복합 IV)

    1. 시토크롬 C의 9 MM 솔루션으로 나트륨 아스 코브 산을 추가하고 인산 완충 1 L의 ° C (10 MM KH 2 PO 4, 산도 7.2)이 5 밀리미터 MgCl 2 포함 4에 밤 솔루션을 dialyzing하여 시토크롬 C를 감소 준비합니다. 포함하는 검정 버퍼를 준비0.1 % 지방산 무료 BSA와 antimycin (2 μg / ML).
    2. 모든 추가 있지만 미토콘드리아가 빈 샘플을 포함하여 48도 투명 판에 샘플을 실행합니다. 각도에, 추가 및 미토콘드리아로 분석 버퍼의 233 μl를 추가하고 5 분을 위해 혼합으로 30 ° C에서 판을 품다.
    3. 감소 시토크롬 C (90 μM 최종 농도)의 추가하여 반응을 시작합니다. 20 초 간격의 3 분의 흡광도 (550 nm 정도)를 기록합니다. 각 잘에 KCN 솔루션 2 μl를 (8 μg / ML) 추가하고 또 다른 2 분의 흡광도를 기록합니다. KCN에 민감한 시토크롬 C 산화와 같은 복잡한 IV 활동을 계산할 수 있습니다. 7

    11. F 0 활동 측정 F 1 ATPase (ATP synthase의)

    1. F 0을 준비 F 1 ATPase 분석 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 200 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 산도 8.2).에게 검정 버퍼에 mitochondrial 펠렛을 다시 중지 liqui에 mitochondrial 샘플을 동결D 질소 천천히 얼음 샘플을 해동.
    2. 48도 투명 판에 triplicates에서 샘플을 실행합니다. 각 치료 그룹에 대해, 2 우물은 잘 (의 275 μl oligomycin 문자를 구분하지 ATPase 활동을 측정하기 위해 총 ATPase 활동 (검정 버퍼의 275 μl, 5 μl mitochondrial 정지하고, 95 % 에탄올 5 μl)와 1 측정 실행됩니다 검정 버퍼, 5 μl mitochondrial 정지, 1 MG / 95 % 에탄올의 ML의 oligomycin 솔루션) 5 μl.
    3. 지속적인 진동과 10 분 31 ° C에서 샘플을 품다. 100 MM ATP 솔루션 (산도 7.0) 16 μl를 추가하고 지속적인 진동과 5 분 31 ° C에서 알을 품다.
    4. 3 M TCA의 50 μl를 포함하는 관에 부화 혼합물의 200 μl를 전송합니다. 10 분을위한 얼음에 샘플을 배양, 4시 5 분 10,000 XG에서 그들을 스핀 다운 ° C. 각각 인산염과 단백질 함량을 결정하기 위해 supernatants와 알약을 사용합니다.
    5. 를 사용하여 supernatants에 인산염 콘텐츠를 확인무기 인산염 분석. 4 SO 3.75의 0.88 g FeSO 4-10 ML MH 2를 추가하고 H 2 O. 90 ML에 적응하여 섬너 시약의 100 ML을 준비 H 2 FeSO 4의 솔루션 4 않으므로 암모늄 molybdate 솔루션 (0.66 g/10 ML H 2 O)의 10 ML을 추가합니다. 빛으로부터 보호합니다.
    6. 및 중복의 각 표면에 뜨는 50 μl - 각 인산염 표준의 50 μl (1,000 μM KH 2 PO 4 0)와로드 96 - 웰 플레이트. 각도에 섬너 시약 250 μl를 추가하고 지속적인 진동과 15 분 30 ° C에서 판을 품다.
    7. 상온에서 595 나노 미터에서 흡광도를 기록합니다. F 0 F 1 ATPase 활동은 우리가 이전에 설명 된대로 ATP의 P 전의 oligomycin에 민감한 자료를 측정하여 결정됩니다. 7,8 총을 계산하고 oligomycin 문자를 구분 F 0 F 1 ATPase 활동. oligomycin에 민감한 ATPase acti을 계산하려면vity, 총 ATPase 활동에서 oligomycin 문자를 구분 활동을 뺍니다. 8,9

    12. 세포 내 ATP 콘텐츠의 측정

    1. 장소 문화 얼음에 RPTC monolayers를 포함하는 요리, 대기음 매체 및 얼음 차가운 PBS 버퍼로 두 번 monolayers을 씻는다. 각 monolayer에 1 ML PBS를 추가 PBS에 각 monolayer을 다쳤고, 그리고 Eppendorf 튜브에 세포 현탁액를 수집합니다. 5 초에 대한 microfuge에서 Eppendorf 튜브에 봐.
    2. ATP Bioluminescence 분석 키트 HS II (로슈)와 제조업체의 프로토콜을 사용하여 루시 페라 방법으로 각 RPTC 샘플에서 ATP 내용을 확인합니다. 각 샘플에서 단백질 농도를 결정하고 MG 단백질 당 ATP 농도 8.을 계산

    13. Mitochondrial 형태론의 시각화

    1. 문화 미디어를 변경합니다. 각 요리 (최종 conc. 100 NM)에 MitoTracker 레드 580 100 μM 솔루션 2 μl를 추가하고 incubato로 요리를 반환30 분을위한 연구.
    2. 물 침적 목표를 사용하여 형광 현미경으로 라이브 monolayers를 검사 5.

    14. 세포 생존 능력 분석

    1. 분석을 시작하기 전에 24 시간에서 apoptosis에 대한 긍정적 인 제어 (annexin V-긍정적 세포)로 봉사 세포를 치료 cisplatin의 50 MM 솔루션 준비합니다. 또한, oncosis에 대한 긍정적 인 컨트롤 (propidium 요오드화물 - 긍정적 세포)로 봉사 세포를 치료 셔리 - butylhydroperoxide 500 MM 솔루션을 준비합니다.
    2. 50 밀리미터 cisplatin 및 터 셔리 - butylhydroperoxide 500 MM 2 μl 수있는 2 개의 요리 2 μl로이 요리를 취급합니다. 노 얼룩 제어를위한 한 요리 최선을 다하고 있습니다.
    3. cisplatin과 TBHP 치료 후 24 시간에서 바인딩 버퍼를 준비 (10 밀리미터 Hepes, 140 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM MgCl 2, 1.8 MM CaCl 2) propidium의 요오드화물 (PI) 솔루션 (50 μg / ML) 바인딩 버퍼 인치
    4. 바인딩 버프를 한 번 monolayers을 씻으십시오어. 얼음처럼 차가운 버퍼 1 ML과 노 얼룩과 annexin V-긍정적 인 셀을 제외한 각 요리에 대한 PI 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 요리를 커버하고 부드러운 궤도 흔들림과 15 분에 얼음에 품다.
    5. 바인딩 버퍼 (10 분)와 monolayers을 씻고 바인딩 버퍼 1 ML과 노 얼룩과 PI-긍정적 인 셀을 제외한 각 요리에 Annexin V-FITC 솔루션 2 μl를 추가합니다. 요리를 커버하고 부드러운 궤도 흔들림과 10 분에 RT에 품다.
    6. 버퍼를 대기음 부드러운 궤도 흔들림과 10 분을위한 얼음에 얼음처럼 차가운 구속력 버퍼 1 ML과 monolayers을 씻는다. 세척 단계를 반복합니다.
    7. 바인딩 버퍼를 기음과 각 요리에 바인딩 버퍼 500 μl를 추가합니다. 부드럽게 고무 경찰관을 사용하여 세포를 긁어 세포 계측법 튜브를 유동 할 셀을 전송합니다. 샘플을 pipetting 아래로하여 단일 세포 현탁액에 세포를 분산. 아무 셀 클러스터을 해봐.
    8. FLO에 의해 즉시 PI와 annexin V-FITC 형광을 수량화w 세포 계측법은 각각 PI 및 FITC를위한 590와 530 nm의에서 488 nm의 및 방출에 흥분을 사용합니다. 각 샘플에 대한 10000 이벤트를 계산합니다.
    9. X-축과 유동 세포 계측법 점 플롯 수치의 Y 축에있는 PI의 형광에 FITC 형광을 놔. PI에 대한 Annexin V에 대한 긍정적이고 부정적인 세포가 apoptotic 간주됩니다. Annexin V에 대한 PI에 대한 긍정적이고 부정적인 세포는 oncotic 간주됩니다. 10,11

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    Representative Results

    그림 1 프로그램 그 adenoviral 전달 RPTC와 미토콘드리아에서 PKC-ε의 크게 증가 단백질 수준에서 PKC-ε 결과의 constitutively 활성 (caPKC-ε)과 비활성 (dnPKC-ε) 뮤턴트 코딩 cDNA. 세포가 비활성화했습니다 cDNA 코딩 dnPKC을 ε overexpressed PKC-ε (phosphorylated되지 않음) (그림 1)에 감염된 반면 caPKC-ε 벡터를 들고 cDNA에 감염된 세포는 PKC-ε의 phosphorylated (활성) 양식을 overexpressed. 활성의 존재는 PKC-ε PKC-ε 비활성 아무 효과 (그림 2) 없다고 반면, 미토콘드리아 에너지를하는 데 사용되는 기판에 관계없이 RPTC에 mitochondrial 호흡을 감소. 호흡 사슬에서 PKC-ε 활성의 목표를 결정하기 위해, 우리는 호흡 사슬의 모든 효소 복합체의 활동을 결정. 그림 3에 도시 된 바와 같이 (그림 4)의 증가와 관련된되었다. 이러한 변경 사항은 F 0의 활동 감소와 함께 한 F RPTC overexpressing 활성화 된 PKC-ε (그림 5A)에서 분리 미토콘드리아에서 1 ATPase (ATP synthase의). 그 결과, RPTC overexpressing의 ATP 내용은 활성이 PKC-ε (그림 5B) 감소. PKC-ε의 지속적인 활성화 mitochondrial 분열 (분열) (그림 6B)를 유도하여 mitochondrial 형태에 깊은 영향을했습니다. PKC-ε 활성화하지만, 억제는 또한 세포 수축을 일으키는 RPTC 형태의 변화 결과 생존 세포의 차 신장. RPTC overexpressing에 Mitochondrial 장애 및 mitochondrial 형태의 변경은 PKC-ε 활성이 oncosis과 apoptosis (그림 7)에서 모두 세포 죽음을 함께했다. 48 시간에서 adenoviral 벡터 전달 후, RPTC overexpressing PKC-ε 활성의 약 50 %는 결혼은 안했습니다. PKC-ε의 비활성 형태의 Overexpression는 mitochondrial 기능과 형태에 아무런 효과가 없으며, RPTC 생존 있습니다.

    따라서, PKC의 cDNA 코딩 다른 isozymes의 adenoviral 배달 신장 세포의 주요 문화에서 개별 PKC의 isozymes 및 활성 또는 비활성 돌연변이의 선택적 overexpression을 사용 효과적인 도구입니다. 이 차 문화에서 자란 세포의 효율적인 transfection와 다른 세포 기능의 조절을 연구 및 단백질 kinases에 의한 세포 형태와 생존 능력의 평가를위한 수 있습니다.

    다닐 "강한 : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 1
    그림 1. phosphorylated (활성) PKC-ε의 단백질 수준 (P-PKC-ε)과 세포 homogenates에서 PKC-ε 총 (왼쪽 패널)와 미토콘드리아 (오른쪽 패널)을 들고 adenoviral 벡터에 감염된 RPTC의 주 문화에서 고립 adenoviral 벡터 배달 후 다른 시간 지점에서 PKC-ε의 constitutively 활성 (caPKC-ε) 또는 운영 중지 뮤턴트 (dnPKC-ε). β-고를의 수준과 F 0 F 1-ATPase는 세포 homogenates와 미토콘드리아, 각각에 대한 젤을로드하는 컨트롤로 사용됩니다. 그림 Nowak 외에서 수정 5.

    그림 2
    그림 2. 주RPTC의 3 uncoupled 호흡은 adenoviral 배송 후 48 H에서 PKC-ε의 활성 및 비활성 돌연변이을 표현. 주 3 호흡를 들어, digitonin-permeabilized 세포의 미토콘드리아는 + 5 밀리미터 말라 테 (기판 복잡한 I를 통해 산화), 10 MM 호박산 + 0.1 μM의 rotenone (기판 복잡한 II를 통해 산화), 또는 1 밀리미터 아스 코브 산 + 1 5 밀리미터 glutamate를 사용하여 활력되었습니다 음, N, N, N ', N'-tetramethyl-P-phenylenediamine (TMPD) (기판 복잡한 IV를 통해 산화). 결과는 평균 ± SE 아르. * - P <0.05.

    그림 3
    그림 3.의 복잡한 I 및 RPTC가 adenoviral 벡터 배송 후 48 H에서 PKC-ε의 활성 및 비활성 돌연변이을 표현으로부터 격리 미토콘드리아에서 복잡한 IV. 활동 결과는 평균 ± SE 아르. * - P <0.05.

    그림 4
    그림 4. 시간에 의존 PKC-ε의 constitutively 활성 (caPKC-ε)과 비활성 돌연변이을 (dnPKC-ε) 수행 adenoviral 벡터와 RPTC 다음과 같은 감염의 mitochondrial 막 전위 (ΔΨm)의 변화. 결과는 JC-1의 monomeric 형태 골재의 비율로 표현됩니다. 결과는 평균 ± SE 아르. * - P <0.05.

    그림 5
    그림 5. F 0 F 활동 절연 미토콘드리아 (A)와 ATP 콘텐츠에 1 ATPase (B)RPTC가 adenoviral 벡터 배송 후 48 H에서 PKC-ε의 활성 및 비활성 돌연변이을 표현 인치 결과는 평균 ± SE 아르. * - P <0.05.

    그림 6
    그림 6. adenoviral 벡터 배송 후 48 H에서 PKC-ε의 활성 및 비활성 돌연변이을 표현 라이브 RPTC에 Mitochondrial 형태.. 비 감염된 제어합니다. B. RPTC는 caPKC-ε을 표현. C. RPTC는 dnPKC-ε을 표현. 라이브 세포의 대표 이미지는 형광 현미경으로 살펴 보았다. 원래 배율, x630.

    그림 7
    R의 그림 7. 시간에 의존 변경PTC oncosis (A)와 apoptosis PKC-ε의 constitutively 활성 (caPKC-ε) 또는 운영 중지 뮤턴트 (dnPKC-ε) 수행 adenoviral 벡터와 (B) 다음과 같은 감염. 빈 pShuttle 벡터를 (나 역시 = 50) 인코딩 adenoviral 입자로 감염이 5.2 결과 ± 2.3 % oncosis 및 5.5 ± 감염 후 48 H에서 1.0 %의 apoptosis합니다. 결과는 평균 ± SE 아르. * - P <0.05. adenoviral 벡터 배송 후 48 H에서 annexin V와 propidium의 요오드화물 형광 RPTC overexpressing에 caPKC-ε과 dnPKC-ε을 보여주는 C. 대표 점 플롯.

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    Discussion

    여기에 제시된 방법은 신장 근위 관 세포의 주요 문화에 PKC의 개별 isozymes의 overexpression 할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점이 있습니다 : 1. 그것은 다양한 모욕 (국소 빈혈, hypoxia, 산화 스트레스), 약물, 그리고 신장에서 nephrotoxicants의 기본 목표 아르 셀 (신장 근위 관 세포)의 동질적인 인구 규제 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. 2. 개선 된 조건에서 차 문화에서 자란 RPTC의 체외 모델에서의 Mitochondrial 기능은 생체 내 신장 근위 tubules의 mitochondrial 기능과 유사. 1,2 3. 체외 모델이 서로 다른 toxicants에 미토콘드리아의 반응은 생체 내 신장 근위 tubules의 반응과 비슷합니다. 4. 이 방법은 신호 전달 mechani에 관여 단백질 등의 특정 단백질을 코딩 유전자의 효율적인 transfection 및 배달이 가능mitochondrial 기능을 조절 SMS. 따라서,이 모델은 kinases와 phosphatases의 constitutively 운영 중 및 운영 중지 isozymes의 선택적 표현 가능하며 같은 선택하지 않으며 종종 독성 부작용이 약리 억제제와 activators의 필요성을 대체합니다. 이 모델의 한계는 다음과 같습니다 1. 체외 환경에서의 배양 RPTC를 사용하면 내분비 및 생체 내 신장 근위 tubules에서 mitochondrial 기능의 조절, 2에 기여 paracrine 신호를 공부에 대해 허용되지 않습니다. 이 모델은 만성 조건을 공부에 대한 허용하지 않습니다.

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    Disclosures

    관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

    Acknowledgments

    이 작품은 국립 보건원, 국립 당뇨병 연구소와 소화기 및 신장병, 2R01DK59558 (GN까지)에서 보조금에 의해 지원되었다. 연구 자료 보조금 UL1 RR029884을위한 건강 국립 센터의 국립 연구소에 의해 지원 UAMS 병진 연구소 UAMS에서 유동 세포 계측법 코어의 일부 자금을 제공했습니다. 우리가 고마워 박사 Peipei 핑 (로스 앤젤레스 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, CA) cDNA PKC-ε 박사 알렌 Samarel (로욜라 메리 대학 의료 센터의 지배적 부정적 (비활성) 돌연변이 코딩 휴대 아데노 바이러스의 나누어지는를 제공, PKC-ε의 constitutively 활성화 돌연변이 코딩 adenoviral 벡터의 나누어지는를 제공 Maywood, IL). 우리는 또한 Drs 감사드립니다. PKC-ε constitutively 활성화 cDNA 코딩을 제공하는 피터 파커와 피터 Sugden (임페리얼 칼리지 런던, 런던, 영국).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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