Summary
여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.
Abstract
네 전사 인자, Oct4, Klf4의 이소성 표현을 통해 Sox2와 cMyc는 인간의 체세포의 세포는 소위 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) 1-4 발생 만능 상태로 변환 할 수 있습니다. 환자 별 iPSCs는 배아 줄기 세포 (ESCs)를 둘러싸고 가능한 면역 거부를 무시할 것이다 윤리적 문제를 부족합니다. 따라서, iPSCs는 질병 모델링 연구, 약리 화합물의 심사 및 재생 치료 5에 대한 상당한 주목을 받고있다.
우리는 야마나카의 요인 6 인코딩 한 excisable polycistronic lentiviral의 줄기 세포 카세트 (STEMCCA)를 사용하여 서로 다른 폐 질환 환자에서 transgene 무료 인간 iPSCs의 생성을 보여 주었다. 이 iPSC 라인은 피부 섬유 아세포, 재 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 세포 유형에서 생성되었습니다. 일반적으로 섬유 아세포를 취득하면 세포의 확장에 의한 펀치 생검은 다음 피부가 필요합니다몇 구절에 대한 문화에 s입니다. 중요한 것은 그룹의 수는 iPSCs 7-9으로 인간의 말초 혈액 세포의 재 프로그래밍을보고했습니다. 한 연구에서, STEMCCA 벡터의 Tet의 inducible 버전은 혈액 세포가 동시에 반대 테트라 사이클린 transactivator 인코딩 constitutively 활성화 lentivirus에 감염 될 필요하는 9 고용되었다. 섬유 아세포는 대조적으로, 말초 혈 세포는 크게 환자의 불편 함과 고통을 감소 최소한 침략 절차를 통해 수령하실 수 있습니다. 제정 한 excisable 벡터를 사용하여 혈액 세포를 재 프로그램에 대한 간단하고 효과적인 프로토콜은 광범위한 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 응용을 촉진 할 수 있습니다. 또한, 주변 혈액 세포의 재 프로그래밍 피부 biopsies을 피할 수 (예. 탈선은 흉터) 또는 인해 기존의 질병 상태 preventi에해야하는 개인의 iPSCs의 생성을 허용펀치 biopsies에 NG 액세스 할 수 있습니다.
여기 constitutively 4 요소를 표현하는 하나의 floxed - excisable lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)에서 인간 iPSCs의 생성을위한 프로토콜을 보여줍니다. 갓 수집하거나 해동 PBMCs은 STEMCCA의 lentivirus와 transduced되기 전에 같은 매체를 포함하는 아스코르브 산에 10,11 설명 구일, SCF, IGF-1, IL-3와 EPO에 대해 확장됩니다. 셀은 다음 MEFs에 도금되어 있으며 ESC와 같은 식민지 두 주 감염 후 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 선택한 클론을 확장하고 pluripotency 마커 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 표현으로 테스트됩니다. 이 프로토콜은 혈액의 쉽게 접근 할 4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법론을 제공, 간단한 튼튼하고 매우 일치합니다.
Protocol
1. 말초 혈 Mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연 및 확장
DAY 0
- 나트륨 시트르산과 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브에 말초 혈 4 ML을 그립니다. 관에게 8-10 번 반전하고 실온에서 30 분에 1,800 XG에 원심 분리기. 이상적으로,이 단계는 컬렉션의 2 시간 이내에 완료해야합니다.
- 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 버피 코트 (겔 장벽과 플라즈마 사이의 세포 층)을 pipetting하여 mononuclear 세포 (MCS)를 수집합니다. 15 분 300 XG에 여러 시간과 원심 분리기 반전, 멸균 인산 버퍼 생리 (PBS)로 10 ML에 총 볼륨을 가져와.
- 멸균 PBS의 10 ML에있는 세포를 Resuspend과 셀 카운트를 수행합니다. 10 분 300 XG에서 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 1 2x10 6 세포를 전송합니다.
- 확장 매체 2 ML (EM) (에서 세포를 Resuspend 50 μg / ML Asco을 포함 QBSF-60 줄기 세포 중rbic 산성, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL-3, 2 U / ML EPO는 40 NG / ML IGF-1, 1 μM의 Dexamethasone 및 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성)과에 이전 일 잘 12 잘 접시의. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.
- 300 x에 남아있는 세포를 원심 분리기 10 % DMSO를 포함하는 FBS에서 10 분, 동결 ~ 2x10 6 셀 / 유리 병에 g.
- 냉동 PBMCs를 사용하여 프로토콜을 시작하려면 10 분 300 XG에 QBSF 매체와 원심 분리기 10 ML로 세포의 1 병을 해동. EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 판 중 하나를 잘에 전송할 수 있습니다. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.
DAY 3 DAY 6
- 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
- 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
- EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend하고 12의 잘 하나 전송- 잘 판. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.
2. STEMCCA Lentivirus과 PBMCs의 전달
9 일
- 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
- 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 5 μg / polybrene 및 STEMCCA lentivirus의 ML을 포함하는 신선한 EM의 1 ML에있는 세포를 Resuspend (전부다 = 1 10)과 12 잘 접시의 잘 하나 전송됩니다. (lentiviral 입자의 생산을 설명하는 프로토콜은에서 찾을 수 있습니다 http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- 90 분에 25 ° C에서 2,250 rpm으로 판을 봐.
- 스핀 후, 신선한 EM의 추가 한 ML을 추가 매체 2 ML의 총 5 μg / polybrene의 ML을 포함하고 37 ° C에서 판을 품다,5% CO 2 인큐베이터.
10 일
- 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
- 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
- EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 접시의 한 우물 전송할 수 있습니다. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.
3. 도금은 MEFs에 셀을 Transduced
DAY 11
- 코트 2x10 5 세포에서 0.1 % 젤라틴과 판 inactivated 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs)와 / 잘 MEF 매체 (IMDM 10 % FBS, 1 % 비 필수 아미노산을 포함, 100 μM의 β-에서 6 잘 접시의 우물 메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민, 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성). 감염 당 3 우물을 준비합니다.
하루에 12
- 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송 그리고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻는다.
- 10 NG / ML bFGF와 아스코르브 산 및 EM에 사용되는 것과 동일한 농도의 성장 요소를 포함하는 MEF 매체의 3 ML에있는 세포를 Resuspend 중간 (50 μg / ML 아스코르브 산, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL -3, 2 U / ML EPO, 40 NG / ML IGF-1, 1 μM Dexamethasone).
- 플레이트 (1) 세포의 ML 당 잘 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의. / 잘 매체의 2.5 ML의 총 bFGF, 아스코르브 산, 및 성장 요인과 MEF 미디어의 1.5 ML를 추가합니다.
- 25 500 rpm으로 판을 돌려 ° C를 30 분에. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 판을 품다.
DAY 14
- 10 NG / ML bFGF와 50 μg / ML 아스코르브 산 (NO 성장 요소)를 포함 MEF 미디어 2.5 ML로 피드 전지는 매일. 기음과 각 피드와 부동 셀을 폐기합니다.
- 로 (보통 일주일에 한 번) 필요한 추가 MEFs을 추가합니다.
- 일단 작은 식민지 피드 세포는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 매체 (DMEM/F12가 포함 된 20 %의 넉 아웃 세럼 교체, 1 % 비 필수 아미노산, 100 μM의 β-메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민 2 ML과 매일 표시 , 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성, 10 NG / ML bFGF).
4. 따기 및 iPSC 클론의 확장
~ DAY 30-40
- 12 잘 판 inactivated MEFs가 / 잘 hESC 매체 1 ML 플러스 Stemolecule Y27632 (ROCK 저해제) 10 μM을 포함하는으로 미리 놓는의 개별 우물에 각 식민지를 선택합니다.
- 만 hESC 매체 (NO ROCK 억제제) 1 ML과 이후 매일 세포를 피드.
5. Pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 착색
- 착색은 Millipore에서 키트 'ES 세포 마커 샘플 키트 "를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다.
6. Integ의 절단정격 STEMCCA 벡터
- 카세트를 재 프로그램의 절단은 Cre-IRES-Puro 표현 벡터에 따라 transfection 및 6에 설명 된대로 간단한 Puromycin 선택을 활용 이루어집니다.
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Representative Results
우리는 하나의 lentiviral 벡터를 사용하여 PBMCs에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 그림 1A는 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 피가 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과로 수집하고 있으며, 원심 분리 후, mononuclear 세포는 폴리 에스터 젤과 플라즈마 (버피 코트) (그림 1b) 사이의 인터페이스에서 수령하실 수 있습니다. 절연 PBMCs 그 다음 구일에 대한 문화에 확장됩니다. 그림 2는 세포가 현저하게 나누어하는 보여주는 일 0 일 9시 PBMCs를 비교합니다. STEMCCA의 lentivirus와 약 10-15일 후 전달은 작은 밝은 식민지의 모습은 여전히 정의되지 않은 식민지의 형태로, 관찰된다. hESC 매체의 추가 후, hESC 같은 식민지 쉽게 (그림 2D) 식별 할 수 있습니다. 이러한 식민지의 일부는 기계, 수령 확장 및 특징이러한 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 (그림 3)과 같은 pluripotency 마커의 표현. 간단한 Puromycin 선택 방법 6을 사용하여, 우리는 그림 4에 묘사로 일관 transgene 무료 iPSC 클론을 얻을 수 있습니다.
1 그림. 말초 혈에서 인간 iPSCs의 생성. STEMCCA 벡터를 사용하여 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)에서 인간 iPSCs를 생성하는 데 사용되는 프로토콜의 A) 도식 표현입니다. EM : 확장 매체, GF : 성장 요인, RBC : 적혈구, MEF : 마우스 배아의 섬유 아세포, hESC : 인간 배아 줄기 세포 B) BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 전체 혈액의 수집에 사용 구연산과 분리를 갖추고 있습니다. mononuclear 세포의. 겔 장벽이 t를 분리 할 때 분리 원심 분리하는 동안 발생밀도가 혈액 구성 요소에서 그는 mononuclear 세포와 플라즈마. 원심 분리 후, mononuclear 세포와 혈소판 막 플라즈마 층 아래에 약간 흰 층 (버피 코트)에서 격리 할 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 프로토콜에 걸쳐 세포의 형태학의 변화를 대표 이미지. A) DAY 0 : mononuclear 세포는 말초 혈액에서 분리 및 확장 매체에 배양되어 있습니다. . 20x 배율 B) DAY 9 : 9 일 문화 확장 후, 세포의 '의 무리 포도 같은'클러스터는 세포가 건강한 것을 제안하고 transduced되기 전에 proliferating (화살표) 관찰하고 있습니다. 20x 배율 C) DAY 20. 식민지 형성 한 주 CE 후 관찰된다재편은 MEFs에 도금되어 있습니다. 10X 배율 D) 30 일 :. iPSC 식민지는 전형적인 형태를 보여 따기 및 확장을위한 준비가 hESC -처럼. 4 배 확대.
그림 3. 혈액에서 생성 된 인간 iPSCs의 특성화. pluripotency 마커 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 표현을 보여주는 PBMCs에서 생성 iPSCs의 Immunofluorescence 분석. iPSCs는 알카라인 인산 가수 분해 효소 (하시죠 Phos)에 대한 긍정적 인 얼룩.
4 그림. transgene 무료 iPSCs의 생성. iPSCs는 플라스미드와 transfected 아르coexpressing Cre recombinase 및 puromycin 저항 유전자가 같은 써머 외, 2010에 설명되어 있습니다. A) iPSCs를 transfection 전에. B) 세포 죽음은 puromycin 선택 C의 두 일 후에 관찰) 새로운 식민지가 transfection 후 십일 주위에 강한 세포로부터 등장 . D) 일부 식민지가 들어서 확대, 그리고 남부 얼룩은 transgene의 절단을 확인하기 위해 수행됩니다. 1, 3, 5, 7 : iPSC의 클론 절단하기 전에, 2, 4, 6, 8 : iPSC 클론 절단 후. 4 배 배율의 모든 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다.
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Discussion
우리는 여기에서 갓 수집 말초 혈의 몇 밀리리터 격리 mononuclear 세포에서 인간 iPSCs를 생성하는 STEMCCA lentiviral 벡터의 사용을 설명합니다. 프로토콜은 먼 위치에서 획득 한 기증자 세포를 활용하면 냉동 PBMCs (버피 코트에서 직접 취득), 상당한 실질적인 의미의 상세를 재설정하는 데 사용할 수 있습니다. 재 프로그램의 유도하기 전에, 절연 PBMCs는 핵 재활 더받을 수있는 세포의 건강한 proliferating 인구를 렌더링 중요한 확장 단계를 받아야합니다. 이것은 쉽게 조혈 문화 조건에서 확장시 세포의 클러스터 '포도 같은의 무리'의 존재에 의해 관찰된다. 이하 5x10 5 세포 transduced 때, 세포는 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의 하나 또는 두 개의 우물에 도금 할 수 있습니다. 우리는 25일 후 전달에 몇 가지 경우에 hESC 같은 식민지를 관찰하는 데 필요한 시간에 몇 가지 변화를 경험하고 있습니다.ROCK 억제제의 사용은 새로운 iPSC 식민지의 채취시 생존과 복제 효율을 향상하는 것이 중요합니다. 현저하게 다시 프로그램 섬유 아세포에서 식민지, 확장 및 cryopreserved 할 수 있습니다 안정적인 iPSC 클론을 설정 다시 프로그램 PBMCs에서 선택한 식민지의 거의 100 %를 따기 때 관찰 것과 대조적 인치 마지막으로, 우리는 매우 효율적이고 일관성 재 프로그래밍 방식으로 결합 된 샘플 모음의 단순함은 여기, iPSC 클론의 큰 숫자가 생성 될 필요가있는 응용 프로그램 타고난 플랫폼을 나타냅니다 설명 있다고 생각합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이러한 연구 GJM와 GM에 대한 NIH UO1HL107443-01 상에 의해 부분적으로 기금을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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