Summary
Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.
Abstract
A través de la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc, las células somáticas humanas se puede convertir en un estado pluripotente, generando así llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS) 1-4. Específicos del paciente iPSCs carecen de las preocupaciones éticas que rodean a las células madre embrionarias (CME) y pasaría por alto el rechazo inmunológico posible. Por lo tanto, iPSCs han atraído una considerable atención por los estudios de modelos de enfermedades, la detección de compuestos farmacológicos y terapias regenerativas 5.
Hemos demostrado la generación de transgén libres de iPSCs humanos de pacientes con enfermedades pulmonares diferentes usando una sola extirpable policistrónico Stem lentiviral casete celular (STEMCCA) que codifica los factores de Yamanaka 6. Estas líneas IPSC se generaron a partir de fibroblastos de la piel, el tipo de célula más común utilizado para la reprogramación. Normalmente, la obtención de fibroblastos de piel requiere un punzón de biopsia seguida por la expansión de la células en la cultura de algunos pasajes. Es importante destacar que, un número de grupos han informado de la reprogramación de células humanas de sangre periférica en iPSCs 7-9. En un estudio, una versión inducible Tet del vector STEMCCA se empleó 9, que requiere las células de la sangre que se infectan simultáneamente con un lentivirus constitutivamente activa que codifica el transactivador inverso tetraciclina. En contraste con los fibroblastos, las células de sangre periférica pueden recogerse a través de procedimientos mínimamente invasivos, reduciendo considerablemente el malestar e incomodidad del paciente. Un protocolo sencillo y eficaz para la reprogramación de células de la sangre utilizando un vector constitutiva sujetos a impuestos especiales solo pueden acelerar la aplicación de la tecnología IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia. Además, la reprogramación de células de sangre periférica permite la generación de iPSCs de individuos en los que las biopsias de piel debe ser evitado (es decir. Aberrante cicatrización) o debido a condiciones de enfermedad pre-existentes Preventing acceso a biopsias.
Aquí se demuestra un protocolo para la generación de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando una única floxed-extirpable vector lentiviral que expresa constitutivamente los 4 factores. PBMC recién arrancadas o descongelados se expanden durante 9 días descrita 10,11 en ácido ascórbico que contiene medio, SCF, IGF-1, IL-3 y EPO antes de ser transducidas con el lentivirus STEMCCA. Después las células se sembraron en MEFs y ESC-como colonias se puede visualizar dos semanas después de la infección. Finalmente, los clones seleccionados se expanden y se ensayaron para la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Este protocolo es simple, robusto y muy consistente, proporcionando una metodología fiable para la generación de iPSCs humanos fácilmente accesible desde 4 ml de sangre.
Protocol
1. El aislamiento y la expansión de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)
DÍA 0
- Dibujar 4 ml de sangre periférica en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio. Invertir el tubo de 8 a 10 veces y centrifugar a 1.800 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Idealmente, este paso se debe hacer dentro de 2 horas de recogida.
- Recoger las células mononucleares (MC) pipeteando la capa leucocitaria (capa de células de barrera entre el gel y plasma) en un tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico. Llevar a un volumen total de 10 ml estéril con salina tamponada con fosfato (PBS), invertir varias veces y centrifugar a 300 xg durante 15 min.
- Resuspender las células en 10 ml de PBS estéril y realizar el recuento de células. Transferir 1 a 2x10 6 células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml cónico y se centrifuga a 300 xg durante 10 min.
- Resuspender las células en 2 ml de medio de expansión (EM) (QBSF-60 Stem medio celular que contenía 50 mg / ml AscoÁcido RBIC, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, dexametasona 1 mM y 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep) y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 10 min y congelación ~ 2x10 6 células / vial en FBS que contenía 10% de DMSO.
- Para iniciar el protocolo utilizando PBMCs congeladas, descongelar 1 vial de células en 10 ml de medio de QBSF y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
Los días 3 y 6
- Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min.
- Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de un 12Y placa. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
2. La transducción de las PBMCs con STEMCCA Lentivirus
DÍA 9
- Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min.
- Resuspender las células en 1 ml de EM fresco que contenía 5 mg / ml de polibreno y lentivirus STEMCCA (MOI = 1 a 10) y la transferencia a un pocillo de una placa de 12 pocillos. (El protocolo que describe la producción de partículas lentivirales se puede encontrar en http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Se centrifuga la placa a 2.250 rpm a 25 ° C durante 90 min.
- Después de girar, agregar un adicional de 1 ml de EM frescas que contiene 5 g / ml de polibreno durante un total de 2 ml de medio y se incuba la placa en un 37 ° C,5% de CO 2 incubadora.
DÍA 10
- Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min.
- Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a 1 pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
3. Revestimiento células transducidas en MEFs
DÍA 11
- Recubrir los pocillos de una placa de 6 pocillos con 0,1% de gelatina y fibroblastos placa inactivadas embriones de ratón (MEFs) a 2x10 5 células / pocillo en medio de MEF (IMDM que contenía 10% de FBS, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β- mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep). Prepare 3 pozos por infección.
DÍA 12
- Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el pozo una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes.
- Resuspender las células en 3 ml de medio de MEF que contiene 10 ng / ml de bFGF, y ácido ascórbico y los factores de crecimiento en las mismas concentraciones que se utilizan en EM media (50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 mM de dexametasona).
- Placa de 1 ml de células por pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía MEFs. Añadir 1,5 ml de MEF medios de comunicación con el bFGF, ácido ascórbico, y factores de crecimiento para un total de 2,5 ml de medio / pocillo.
- Se centrifuga la placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Se incuba la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
DÍA 14
- Células de alimentación cada dos días con 2,5 ml de medio de MEF que contienen 10 ng / ml de bFGF y 50 ug / ml de ácido ascórbico (sin factores de crecimiento). Aspirar y desechar las células flotantes con cada toma.
- Añadir MEFs adicional cuando sea necesario (generalmente una vez a la semana).
- Una vez que aparecen pequeñas colonias, las células de alimentación diaria con 2 ml de células madre embrionarias humanas (hESC) medio (DMEM/F12 que contiene reemplazo del 20% Knockout Serum, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina , 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep y 10 ng / ml de bFGF).
4. Picking y expansión de clones de IPSC
~ DÍA 30 a 40
- Recoger cada colonia en pocillos individuales de una placa de 12-así pre-siembra con MEFs inactivada que contiene 1 ml / pocillo de medio de hESC más 10 mM de Stemolecule Y27632 (ROCK inhibidor).
- Alimentar a las células al día posteriormente con 1 ml de medio de hESC sólo (sin inhibidor ROCK).
5. La tinción de inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia
- La tinción se realizó utilizando el kit "célula ES Marker Kit de muestra" de Millipore y siguiendo el protocolo del fabricante.
6. Escisión de Integnominal STEMCCA Vector
- Escisión de reprogramación casete se logra utilizando un Cre-IRES-Puro expresando vector de transfección y tras breve selección puromicina como se describe 6.
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Representative Results
Se demuestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos a partir de PBMCs utilizando un vector lentiviral único. Figura 1A muestra una representación esquemática del protocolo. La sangre se recogió en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio, y después de la centrifugación, las células mononucleares se pueden recoger de la interfaz entre el gel de poliéster y el plasma (buffy coat) (Figura 1B). Las PBMC aisladas se expanden en cultivo durante 9 días. Figura 2 compara las PBMCs en el día 0 y el día 9, mostrando que las células son notablemente divisoria. Aproximadamente 10-15 días después de la transducción con el lentivirus STEMCCA, aparición de pequeñas colonias brillantes se observan, con morfología de las colonias todavía sin definir. Después de la adición de medio de células madre, como hESC-colonias pueden ser fácilmente identificados (Figura 2D). Algunas de estas colonias se recogieron mecánicamente, se expandió y se caracterizapara la expresión de marcadores de pluripotencia como SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81 (Figura 3). Utilizando un enfoque de puromicina breve selección 6, que son capaces de obtener consistentemente transgén libres de clones IPSC como se representa en la figura 4.
Figura 1. Generación de iPSCs humanos de sangre periférica. A) Representación esquemática del protocolo utilizado para generar iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el vector STEMCCA. EM: Media Expansión; GF: Factores de crecimiento; RBC: los glóbulos rojos; MEF: fibroblastos de ratón embrionario, células madre: células madre embrionarias humanas B) BD Vacutainer CPT Celular Preparación del tubo con citrato de sodio utilizado para la recogida de sangre total y la separación. de células mononucleares. La separación se produce durante la centrifugación cuando la barrera de gel separa tél células mononucleares y del plasma de los componentes más densos de sangre. Después de la centrifugación, las células mononucleares y las plaquetas puede ser aislado de una capa blanquecina (buffy coat) justo debajo de la capa de plasma. Haga clic aquí para ampliar la figura .
Figura 2. Imágenes representativas de los cambios morfológicos de las células de todo el protocolo. A) Día 0: Las células mononucleares se aislaron de sangre periférica y se cultivaron en medio de expansión. . 20 aumentos B) Día 9: después de la expansión en cultivo durante 9 días, 'racimo de uvas-como "grupos de células se observó (flechas) lo que sugiere que las células son sanas y proliferación antes de ser transducidas. 20 aumentos C) Día 20:. Formación de colonias se observa una semana después de la cells se siembran en MEFs. Un aumento de 10x D) DIA 30:. HESC-como colonias IPSC mostrar morfología típica y están listos para la cosecha y la expansión. Ampliación 4x.
Figura 3. Caracterización de iPSCs humanos generados a partir de la sangre. El análisis de inmunofluorescencia de iPSCs generados a partir de PBMCs que muestran la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Los iPSCs también tinción positiva para fosfatasa alcalina (Alk Phos).
Figura 4. IPSCs generación de transgén libres de iPSCs. Son transfectadas con un plásmidocoexpressing Cre recombinasa y un gen de resistencia a puromicina, como se describe en Somers et al, 2010. iPSCs A) antes de la transfección. B) La muerte celular se observa después de dos días de selección puromicina C) surgen nuevas colonias de células resistentes a alrededor de 10 días después de la transfección . D) Algunas colonias se recogen y se expandió, y transferencia de Southern se realizó para confirmar la escisión del transgén. 1, 3, 5 y 7: clones IPSC antes de la escisión; 2, 4, 6 y 8: clones IPSC después de la escisión. Todas las imágenes de contraste de fase a un aumento de 4x.
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Discussion
Nos en la presente memoria se describe el uso del vector lentiviral STEMCCA para generar iPSCs humanos a partir de células mononucleares aisladas de unos pocos mililitros de sangre periférica recién recogida. El protocolo también se puede utilizar para reprogramar PBMCs congeladas (obtenidos directamente a partir de la capa leucocitaria), un detalle de importantes implicaciones prácticas cuando se utilizan células de donantes adquiridos desde una ubicación distante. Antes de la inducción de la reprogramación, PBMCs aisladas deben someterse a una etapa de expansión crítico que hace que una población saludable proliferación de las células más susceptibles de reprogramación nuclear. Esto se observa fácilmente por la presencia de "racimo de uvas-como" grupos de células después de la expansión en condiciones de cultivo hematopoyéticas. Cuando es menor que 5x10 5 células son transducidas, las células se pueden sembrar en uno o dos pocillos de una placa de 6 pocillos que contenía MEFs. Hemos experimentado una cierta variabilidad en el tiempo necesario para observar como hESC colonias, en algunos casos hasta 25 días después de la transducción.El uso de un inhibidor de ROCK es fundamental para mejorar la supervivencia y la eficacia de clonado a recoger de las nuevas colonias IPSC. Sorprendentemente y en contraste con lo observado al momento de retirar las colonias de fibroblastos reprogramados, prácticamente el 100% de las colonias de PBMCs recogidos reprogramadas establecen clones estables IPSC que se pueden ampliar y criopreservados. Finalmente, creemos que la simplicidad de la recolección de la muestra se combina con el enfoque altamente eficiente y consistente reprogramación se describe en la presente memoria, representa una plataforma de buena fe para aplicaciones en las que un gran número de clones IPSC necesitan ser generado.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estos estudios fueron financiados en parte por el NIH UO1HL107443-01 Premio a GJM y GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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