ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。
毛包の形態形成、上皮由来ケラチノサイトと基礎の間充織間の相互作用を必要とする複雑なプロセスは、器官形成および組織特異的シグナル伝達を研究するための魅力的なモデル系である。毛包の発達は、遺伝的に扱いやすいですが、このプロセスのための本質的な要因を迅速かつ再現性の分析が課題として残されている。ここでは、ターゲットに過剰発現または組織特異的にレンチウイルスを用いた要因のshRNAによるノックダウンを生成する手順について説明します。毛髪再生モデル5、6、11の修正版を使用して、我々は、毛包の形態形成につながる上皮間葉シグナル伝達経路の研究を促進するために、堅牢なゲインまたはプライマリマウスケラチノサイトや真皮の細胞における機能喪失型の分析を実現することができます。我々は、レンチウイルスcontaiを届ける、毛乳頭細胞やその前駆体を含む新鮮な一次マウスケラチノサイトおよび真皮細胞を分離する方法について説明し細胞集団の一つにshRNAまたはcDNAのどちら寧、およびヌードマウスの背中に完全に形成された毛包を生成するためにセルを結合します。このアプローチでは、三週間以内に、毛包を生成するために必要な組織特異的な要因の分析を可能にし、既存の遺伝モデルに迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。
髪の再構成アッセイは、de novoの毛包形成のメカニズムを調べるためのユニークな臓器再生のモデルを提供します。ここでは、毛包形成における遺伝子の機能を決定するために有用で修正されたチャンバー髪アッセイを説明します。我々のアッセイは、我々はどちらかの真皮または表皮の細胞型において遺伝子の過剰発現またはノックダウンを達成するためのレンチウイルス発現技術を導入するために変更された報告室ヘア再構成アッセイ5、6,11、に基づいています。我々のアッセイは、組織特異的遺伝子ノックアウトを生成するために迅速な代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは移植コレクションにレンチウイルスで初代細胞を感染から、わずか3週間で毛包形成における遺伝子機能を発揮することができます。我々のアッセイが1つの細胞型12にレンチウイルスによって組み合わせのshRNA / cDNAの配信を使用して遺伝的相互作用に対処するために拡張することができるだけでなく、真皮と表皮細胞の代表値との間のシグナリングの検査を可能にするES。
微妙な欠陥が観察しにくいですしながら私たちの髪アッセイは最高の、毛包の再生に強いゲインまたは機能喪失表現型を検出するのに適しています。我々は正常に私たちの毛髪再生アッセイ1,12を使用していくつかの遺伝子の真皮の特定の遺伝子の機能を明らかにした。 GFPマーカーに基づいたshRNAの10を発現するレンチウイルスベクターからの共発現は、ドナーの皮膚細胞を発現shRNAが再生された毛の移植に固執していることを実証した。 GFP陽性細胞は、再生毛包の毛乳頭(DP)( 図3)で存在していた。細胞はGFPのさまざまなレベルを表現したのであるDP細胞はおそらく遺伝子ノックダウンの異なるレベルから成っていた、このように観察された毛包の表現型はnullに遺伝わい小体型の範囲であった。
このアッセイのための1つの改善はgraftin前に高shRNAを発現する細胞のための迅速かつ効率的な選択を確立することであろうグラム強いGFP発現細胞を精製するためにFACSを使用するなど。代替案は、このアッセイ9に変異または条件付きノックアウト細胞を置き換えることです。一次皮膚細胞は継代培養された後DPの効力が徐々に失われるので、一方に、DP細胞機能を維持することができる培養システムは非常に便利です。潜在的な培養システムは、人工ニッチまたは集約文化2,7,8,13由来生体材料の使用が含まれる。もう一つの改善点は、これは皮膚固有の損失またはで新鮮ケラチノサイト生成する仔マウスの第2のセット(ステップ7)の使用量を削減するように高い細胞回収率を持つ信頼性の高い表皮細胞凍結法の利得のを生成することになります機能研究。
髪の成長がやや少ない同期化され、卵胞の向きがよりランダムですが、このチャンバー髪アッセイは、毛包の密度と通常のマウスの皮膚と同様の品質を生成します。毛髪再生遺伝アッセイ含めたいくつかの制限電子レンチウイルスと細胞数の大量の要件、そして、それはそのようなパッチやフラップアッセイ3,4,14など髪の再構成アッセイの他の形態に比べて外科的方法の面で非常に集中的な労働である。しかし、髪の成長を検出するために毛包とタイムラインの品質は他のアッセイ4よりも優れています。私たちのターゲットと毛髪再生アッセイは、既存の遺伝的モデルへの迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH NRSA 1F32CA14208701(SXA)とNIH助成AR052785とAR046786(AEOとW-MW)によってサポートされていました。
Name | Company | Catalog # | Comments |
PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
Dispase | Roche | 4942078001 | |
Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |