이득 또는 손실 기능을 중재 할 lentivirus를 사용하여 머리 소낭 재생 모델의 조직 별 분석.
헤어 소낭의 morphogenesis, 상피 조직이 나왔죠 파생 keratinocytes과 기본 mesenchyme 간의 상호 작용을 필요로하는 복잡한 과정은 장기 개발 및 조직 별 신호를 공부 할 수있는 매력적인 모델 시스템입니다. 헤어 대과 개발이지만이 과정에 필수적인 요소의 유전자 다루기 쉬운, 빠르고 재현 분석은 도전 남아 있습니다. 여기 타겟팅 overexpression 또는 조직 별 방식으로 lentivirus를 사용하여 요소의 shRNA로 인한 최저를 생성 할 수있는 절차를 설명합니다. 헤어 재생 모델 5, 6, 11의 수정 된 버전을 사용하여, 우리는 헤어 소낭의 morphogenesis로 이어질 상피 – 중간 엽 신호 경로의 연구를 촉진하기 강력한 이득 또는 기본 마우스 keratinocytes 또는 피부 세포의 손실 기능 분석을 달성 할 수 . 우리는 lentivirus contai을 제공, 신선한 기본 마우스 keratinocytes과 피부 유두 세포 및 전구 물질을 포함 피부 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다세포 인구 중 하나에 shRNA 또는 cDNA 중 하나를 닝, 그리고 누드 마우스 실려 완전히 형성 모낭을 생성하는 세포가 조화를 이루고 있습니다. 이 방법은 3 주 이내에 모낭을 생성하는 데 필요한 조직 별 요인의 분석이 가능하고 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.
헤어 reconstitution의 assays는 드 노보 헤어 소낭 형성의 메커니즘을 조사에 대한 고유 한 장기 재생 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 결정하는 데 유용 수정 챔버 헤어 분석을 설명합니다. 우리 검정 우리가 피부 또는 표피 세포 유형 중 하나에 유전자 overexpression 또는 분해를 달성하기 lentiviral 표현 기법을 소개하도록 수정보고 챔버 헤어 reconstitution 분석 5, 6,11,에 기반을두고 있습니다. 우리 분석은 조직 별 유전자 녹아웃을 생성 할 수있는 빠른 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 그라프 트 컬렉션에 lentivirus와 기본 세포를 감염에서 최소 셋처럼 주 헤어 소낭 형성에 유전자 기능을 설명 할 수 있습니다. 우리 검정은 한 셀 타입 12에 lentivirus에 의해 조합 shRNA / cDNA 전송을 사용하여 유전자 상호 작용을 해결하기 위해 확장 할 수 있습니다뿐만 아니라 피부 및 표피 세포 사이에 신호의 일반 시험을 할 수 있습니다에스.
미묘한 결함이 관찰 어렵 동안 우리의 머리 분석은 가장, 헤어 소낭 재생에 강한 이득 또는 손실 기능 phenotypes을 검출에 적합합니다. 우리는 성공적으로 우리의 머리 재생 분석 1,12를 사용하여 몇 가지 유전자의 피부 특정 유전자의 기능을 보여주고 있습니다. GFP 마커에 따라 shRNA 10을 표현 lentivirus 벡터에서 공동이 – 표현, 우리는 기증자 피부 세포를 표현 shRNA가 생성 헤어 이식에 지속되는 보여 주었다. GFP 양성 세포는 재생 모낭 (그림 3)의 피부 유두 (DP)에 참석했다. 셀 따라서 관찰 헤어 소낭의 표현형은 null로 유전 hypomorph에서 다양한이었고, GFP의 수준을 다양한 표현으로 DP 세포 가능성이 유전자 최저의 다른 수준으로 구성.
이 분석에 대한 하나의 개선 graftin 전에 높은 shRNA 표현 세포에 대한 신속하고 효율적인 선택을 확립하는 것입니다g 강한 GFP-표현 세포를 정화하기 위해 FACS를 사용하여 같은. 대안이 검정 9 돌연변이 또는 조건부 녹아웃 세포를 대체하는 것입니다. 기본 피부 세포 passaged하고 나면 DP의 효력이 점차 손실로 다른 한편으로는, DP 세포 기능을 보존 할 수있는 문화 시스템은 매우 유용합니다. 잠재적 인 문화 시스템은 인공 틈새 또는 집계 문화 2,7,8,13에서 파생 biomaterials의 사용을 포함합니다. 또 다른 개선이 피부에 특정한 손실 또는 신선한 keratinocytes 생성하기 위해 마우스 새끼의 두 번째 세트 (7 단계)의 사용을 줄일 수로 높은 휴대 복구 속도 신뢰할 수있는 표피 세포 동결 방법 이득의를 생성하는 것입니다 기능을 연구.
머리 성장이 약간은 덜 동기화 고치 방향이 더 무작위입니다 있지만, 이러한 챔버 헤어 분석, 헤어 소낭 밀도와 일반 마우스 피부와 유사한 품질을 생산하고 있습니다. 머리 재생 유전자 분석의 몇 가지 제한이 includ전자 lentivirus와 전화 번호의 대량의 요구 사항, 그리고 이러한 패치와 플랩 assays 3,4,14 등의 헤어 reconstitution의 assays 다른 형태의에 비해 수술 방법의 측면에서 집중적 매우 노동입니다. 그러나, 머리의 성장을 감지하는 모낭과 타임 라인의 질은 다른 assays 4 우수합니다. 우리 목표 헤어 재생 분석은 기존 유전 모델에 빠르고 편리 동반자를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA)와 NIH 보조금 AR052785 및 AR046786 (AEO 및 W.-MW)에 의해 지원되었다.
Name | Company | Catalog # | Comments |
PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
Dispase | Roche | 4942078001 | |
Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |